从原代解离的神经元培养物中高效分离富集的轴突质

《Methods》：Streamlined isolation of enriched axoplasm from primary dissociated neuronal cultures

　　

Sabta Alarcón|Andrés Fuentes|Elizabeth Carrazana|Karen Fabres|Paulina Bahamonde|Mario Sanhueza|Natalia Salvadores

智利特木科大学生物医学中心神经退行性疾病实验室

摘要

轴突是高度特化的神经元结构，其生长、维持和突触功能依赖于局部分子调控。轴突的细胞质成分统称为轴浆，这一成分在神经元发育和疾病研究中具有核心作用。然而，对轴浆的生化分析在技术上具有挑战性，尤其是在分离的神经元培养物中，因为轴突和细胞体混合在一起，且轴突物质有限。因此，大多数针对轴浆的研究依赖于组织培养或外周神经元模型，这限制了对分离中枢神经系统神经元轴突的直接生化分析。在这里，我们描述了一种简单而可靠的方法，可以有效地将细胞体和轴突从原代分离的神经元培养物中分离出来，并回收富集的轴浆组分。使用一种定制的重组装置，神经元会重新组织成紧凑的细胞体簇，从中延伸出放射状的轴突，从而便于手动分离细胞体和轴突物质。形态学和免疫荧光分析显示，细胞体和轴突成分能够被有效分离。生化和分子验证表明，轴浆组分富含轴突特异性蛋白质和转录本，同时缺乏核标记物和基因组DNA，为从分离的神经元培养物中分离轴浆提供了一种实用且可行的方法。通过这种方法，我们可以对那些难以获取的神经元类型的轴突物质进行生化分析，从而扩展了研究神经元发育、可塑性和疾病中轴突特异性分子机制的实验工具箱。

引言

神经元是极化程度最高的细胞之一。它们极端的形态和功能分化使得它们能够接收、整合并远距离传递信息。这种极性不仅体现在神经元结构上，还体现在细胞的分子组成上：细胞体、树突、轴突和突触前末端各自含有不同的RNA、蛋白质和细胞器[1]、[2]、[3]。在这些结构中，轴突具有独特的特性：它可以从细胞体延伸几厘米到几米，并且必须在与细胞核保持物理距离的情况下维持生长、导向、维持和突触功能。因此，轴突依赖于局部调控的分子机制，这些机制在神经元发育、可塑性和疾病中起着越来越重要的作用[4]、[5]、[6]。轴突的细胞质成分（即轴浆）代表了一个在生化和功能上独特的亚细胞区域，受到局部调控。

早期的神经生物学模型认为，轴突所需的大部分蛋白质是在细胞体中合成后运输到轴突中的[7]。然而，先驱性研究表明，轴突内部含有复杂的mRNA库和局部翻译所需的机制。直接证据表明，分离的轴突可以在响应细胞外信号（如神经营养因子或导向分子）时局部翻译特定的mRNA[8]。后续研究证实，局部翻译对于轴突导向、损伤后的再生、突触形成和突触可塑性是必需的[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。同时，蛋白质组学研究揭示了轴突的分子组成与细胞体不同，包括专门的细胞骨架调节因子、运输机制、代谢酶和信号蛋白[14]、[15]。轴突RNA运输和局部蛋白质合成的失调与神经发育障碍、神经退行性疾病和周围神经病变（包括肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症和阿尔茨海默病）有关[16]、[17]、[18]、[19]。这些发现强调了将轴突视为自主的生化结构而非细胞体的被动延伸的必要性。

尽管轴突自主性的概念很重要，但由于技术挑战，定义轴突转录组和蛋白质组的进展一直受到限制。在传统的神经元培养物中，轴突和细胞体在空间上重叠，难以在不受到细胞体或树突成分污染的情况下分离轴突物质。由于轴突中的RNA和蛋白质含量远低于细胞体，即使是微量的污染也会影响后续分析。因此，开发出能够物理分离轴突和细胞体的方法对该领域至关重要。最早的实现细胞体-轴突分离的方法是由Campenot开发的隔离培养系统。在该系统中，神经元在中央腔室中培养，而轴突通过狭窄的沟槽或屏障延伸到流体隔离的侧腔室[20]。尽管这种方法非常有效，但组装起来相对费力，且更适合外周神经元（如背根神经节神经元），而不适合来自中枢神经系统的神经元。最近，微流控隔离装置已成为广泛采用的轴突-细胞体分离平台。这些装置通常由两个或多个腔室组成，通过微沟槽阵列连接，允许轴突通过而不允许细胞体通过。流体隔离使得可以选择性地处理轴突或细胞体，从而实现高纯度的分析[21]、[22]、[23]。尽管取得了这些进展，现有方法获得的轴突物质量仍然有限，限制了后续的分子或生化分析。

重要的是，在外周神经元模型（如背根神经节神经元）中研究轴浆要容易得多，因为它们的轴突较长且结构稳定，轴突与细胞体的比例也较为理想[24]。相比之下，在分离的脑源性神经元中研究轴浆面临更大的技术挑战，包括较低的轴突生物量、更高的形态复杂性以及较高的细胞体或树突污染风险。因此，目前还没有方法能够在分离的脑源性神经元（如海马或皮质神经元）中高效地分离细胞体和轴突，并进行轴突组分的生化分离。在这种情况下，开发新的装置以实现细胞体和轴突的有效分离是一个重要的方法学进步。在这里，我们描述了一种方法，可以促进分离神经元中的轴突放射状排列，从而实现可靠的物理分离，并回收适合后续分子和生化分析的富集轴浆组分。

章节片段

重组腔室

重组腔室是使用SILGARD 184硅弹性体套件（Dow, Silicone Corporation）制造的。按照制造商的说明混合弹性体基材和固化剂，然后倒入标准培养皿中形成均匀的层。弹性体在室温下固化后，将固化的材料从培养皿中取出并切割成4×8×8毫米的方块。每个方块上使用2毫米的孔径制作了四个圆形孔。

结果与讨论

为了评估该装置是否支持神经元的稳健生长并实现有效的细胞体-轴突分离，我们对使用该平台培养的神经元进行了系列形态学、分子和生化表征。神经元培养由三位不同的研究人员独立完成，并使用该装置进行处理，实验结果一致。

结论

在这项研究中，我们描述了一种简单而可靠的方法，可以从分离的脑源性神经元中有效分离细胞体和轴突，并回收适合分子和生化分析的富集轴浆。通过促进皮质和海马神经元中的轴突放射状排列，该方法使得中枢神经系统神经元在轴浆研究中变得易于操作。

作者贡献

S.A.、A.F.、E.C.、K.F.、P.B.和M.S.进行了研究并分析了数据，N.S.设计了研究并监督了研究过程，并撰写了手稿。

资金来源

本研究得到了Fondecyt 11240712项目的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。