万古霉素(Vancomycin)联合贞芪颗粒(Zhenqi Granule, ZQ)抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的效果优于单用万古霉素

《Microbial Pathogenesis》：Vancomycin combined with Zhenqi Granule can inhibit Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus more effectively than Vancomycin alone

　　

目的：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)对万古霉素(Vancomycin, Van)的耐药性逐渐增强，尤其见于生物膜(biofilm)相关感染。本研究探讨Van与具有已知抗菌活性的中药复方贞芪颗粒(Zhenqi Granule, ZQ)联用作为克服Van耐药潜在策略的作用。方法：采用微量肉汤稀释棋盘法及生长曲线测定Van与ZQ对浮游态MRSA的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)及联合效应；通过菌落计数和共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)评估生物膜活性；酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测生物膜基质成分胞间多糖黏附素(polysaccharide intercellular adhesin, PIA)、胞外DNA(extracellular DNA, eDNA)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)水平；碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色及透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察细胞膜通透性与细胞壁超微结构；实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR, RT-PCR)检测生物膜及细胞壁磷壁酸(wall teichoic acid, WTA)合成相关基因的表达。结果：Van与ZQ对MRSA的MIC分别为1 μg/mL和25 mg/mL。1/2×MIC Van联合1/2×MIC ZQ可在24 h内完全抑制浮游MRSA生长并显著降低生物膜活性；生物膜基质中PIA、eDNA及环二腺苷酸(cyclic di-adenosine monophosphate, c-di-AMP)水平明显下降；ZQ可提高胞外AKP活性、增强膜通透性并诱导胞质收缩(plasmolysis)；联合用药还显著下调生物膜相关基因(icaA、purF)及WTA合成基因(tarH、fmtA、dltA)的转录。结论：Van联合ZQ可有效抑制浮游及生物膜状态MRSA的生长，协同机制涉及ZQ破坏细胞壁完整性从而增强Van对MRSA生物膜的抗菌作用，为MRSA感染的联合治疗提供了潜在策略。

论文解读：万古霉素联合贞芪颗粒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用及机制研究

【研究背景】

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是临床常见多重耐药病原菌，其引发的难治性感染给临床治疗带来严峻挑战。万古霉素(Vancomycin, Van)作为抗MRSA一线糖肽类抗生素，通过与细胞壁前体脂质Ⅱ的D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-alanyl-D-alanine)末端特异性结合，阻断肽聚糖合成的转糖基化和转肽步骤抑制细胞壁形成。然而临床上已出现万古霉素中介菌株，表现为肽聚糖生物合成途径改变（如细胞壁增厚或D-Ala-D-Ala末端修饰），导致Van敏感性下降。MRSA细胞壁磷壁酸(wall teichoic acid, WTA)是含量最丰富的表面决定簇，参与细菌定植与感染，其生物合成受第二信使c-di-AMP(cyclic di-adenosine monophosphate)调控；Van可诱导MRSA适应性反应使WTA发生β-糖基化修饰促进细胞壁增厚且交联度降低，形成"诱饵结合位点" sequestrate Van，加之WTA线性结构含带负电的核糖醇磷酸(ribitol phosphate, RboP)基团结合正电D-丙氨酸赋予两性离子特性，而生物膜(biofilm)形成的物理屏障进一步限制Van扩散并增强包埋菌的抗生素耐受性，因此靶向WTA生物合成是应对MRSA Van耐药的有前景策略。贞芪颗粒(Zhenqi Granule, ZQ)系由黄芪(Astragalus membranaceus)与女贞子(Ligustrum lucidum)组成的中药复方，黄芪中黄芪甲苷(astragaloside)具抗细菌感染炎症功效且黄毛峞茶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生长有抑制作用，女贞子中齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)可通过调节肽聚糖合成及毒力因子表达基因抑制革兰氏阳性菌，中西药联用是当前抗微生物研究中经证实的 promising 治疗手段。本研究由中国中医科学院基本临床研究所有研究人员开展，旨在验证Van与ZQ联用对MRSA浮游态及生物膜态的体外抗菌效力，阐明ZQ的抗菌机制并评估其对细胞 WTA 生物合成相关基因(tarH、fmtA、dltA)表达的影响，为优化抗MRSA联合方案提供证据，论文发表于《Microbial Pathogenesis》。

【主要关键技术方法】

研究人员使用ATCC 43300标准MRSA菌株，通过CLSI标准微量肉汤稀释法测MIC；改良8×8矩阵棋盘稀释法计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index, FICI)判定协同/相加/无关/拮抗；酶标仪连续监测OD_600nm绘制生长曲线；成熟生物膜经药物处理后结晶紫或活死染色结合菌落形成单位(colony-forming unit, CFU)计数与CLSM评估存活；ELISA定量PIA、eDNA及c-di-AMP、胞外AKP；酚氯仿法提取纯化eDNA后NanoDrop测浓度纯度；PI染色后倒置荧光显微镜观察膜通透性；TEM观察细胞壁超微结构变化；Trizol法提取总RNA反转录为cDNA后qRT-PCR以16S rRNA为内参用2^?ΔΔCt法分析icaA、purF、tarH、fmtA、dltA相对表达量；CCK-8法检测人A549与HepG2细胞活力初步评价细胞毒性。

【研究结果】

3.1. Inhibitory Effects of Van and ZQ on Planktonic MRSA（Van与ZQ对浮游态MRSA的抑制作用）

研究人员测得Van与ZQ对浮游MRSA的MIC分别为1 μg/mL和25 mg/mL。棋盘法显示FICI=1为相加效应。1/2×MIC Van(0.5 μg/mL)+1/2×MIC ZQ(12.5 mg/mL)联用在24 h内完全抑制细菌生长，效果等同于1×MIC ZQ单药；单用1/2×MIC Van早期(前12 h)抑制较强但14 h后细菌再生长，单用1/2×MIC ZQ初期抑制较弱但维持持续抑制，联用实现完全持久抑制。CCK-8显示所用浓度下联用未明显降低A549与HepG2细胞活力。

3.2. Inhibitory Effects of Van and ZQ on MRSA Biofilms（Van与ZQ对MRSA生物膜的抑制作用）

成熟MRSA生物膜较浮游菌耐药性强，1×MIC Van单药不能显著抑制生物膜生长，1×MIC ZQ单药可明显抑制，1/2×MIC Van+1/2×MIC ZQ联用抑制效果强于任一方单药。CLSM活死染色显示1×MIC Van组生物膜结构完整以活菌(绿光)为主，1×MIC ZQ组广泛死菌(红光)伴微小菌团，联用组几近全红无可见菌团结构，表明联用增强Van向生物膜内渗透并杀灭包埋菌。ELISA显示各给药组PIA降低，仅含ZQ组(1×MIC ZQ及联用)eDNA显著下调；ZQ比Van更显著抑制c-di-AMP。qRT-PCR示Van与ZQ均抑制icaA(编码PIA合成)，Van显著抑制purF(c-di-AMP前体合成相关)，ZQ对purF影响小，联用对icaA与purF抑制最强。

3.3. ZQ-Induced Alterations in MRSA Cellular Architecture（ZQ诱导MRSA细胞结构改变）

胞外AKP释放提示ZQ处理组(1/2×MIC及1×MIC)6 h与12 h胞外AKP升高提示膜通透性增加但弱于1×MIC Van。PI染色示ZQ暴露组呈剂量依赖性红色荧光增强，1×MIC Van与1×MIC ZQ荧光强度相当。TEM显示对照组细胞壁膜完整，1×MIC ZQ组出现胞质收缩(plasmolysis)及结构完整性丧失。渗摩尔浓度测定排除ZQ高浓度渗透压效应的主要贡献。

3.4. Transcriptional Regulation of WTA Biosynthesis Genes by Van and ZQ（Van与ZQ对WTA生物合成基因的转录调控）

Van轻微下调tarH与dltA，ZQ显著下调fmtA与dltA，联用(1/2×MIC Van+1/2×MIC ZQ)显著下调全部三个WTA合成基因tarH、fmtA、dltA且对fmtA抑制最显著。分子对接提示Van及ZQ主要成分(黄芪甲苷IV、女贞苷)与TarH、FmtA、DltA蛋白具良好预测结合能。

【讨论与结论翻译】

讨论指出Van仍是MRSA感染一线用药但通过 altered细胞壁合成致耐药且生物膜阻碍药物渗透，天然药物联合抗生素因削弱生物膜屏障提高渗透性成为有前景策略；ZQ虽早期抑制弱于Van但抗生物膜活性抑制后期再生长故联用实现持续抑制；WTA占MRSA细胞壁质量60%，c-di-AMP正向调控tarH(WTA转运ABC转运蛋白TarGH亚基)表达，ZQ降c-di-AMP可能间接抑制tarH转录，联用协同下调tarH、fmtA、dltA(FmtA为细胞分裂隔膜形成转肽酶将LTA上D-Ala转移至WTA，dltA属dltABCD操纵子控制D-Ala酯化调节表面电荷与黏附)，破坏WTA合成与D-Ala掺入及生物膜基质(PIA、eDNA)形成从而损害细胞壁完整性；女贞子所含五环三萜类(齐墩果酸、熊果酸)可协同β-内酰胺抑制金葡菌浮游及生物膜并调节耐药，黄芪酚类黄酮对革兰氏阳性菌抑制更强因其肽聚糖含量低；仍需明确ZQ直接作用的生物膜形成通路、定量细胞壁表面WTA含量及D-Ala修饰水平、进行药代动力学与体内安全性验证。

结论翻译：本研究表明万古霉素(Vancomycin, Van)与贞芪颗粒(Zhenqi Granule, ZQ)联用可有效抑制浮游态及生物膜态耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的生长。其潜在机制涉及药物联用下调关键细胞壁磷壁酸(wall teichoic acid, WTA)生物合成基因(tarH、fmtA及dltA)转录，导致MRSA细胞壁完整性受损，从而增强Van对生物膜期MRSA的抑制效力。这为应对MRSA万古霉素耐药及开发基于ZQ的抗菌制剂并联合抗生素的临床策略奠定了基础。