这种源自猪的化合物——芽孢杆菌，通过重塑肠道屏障和微生物平衡，有效缓解了仔猪感染猪流行性腹泻病毒的情况

《Microbial Pathogenesis》：The porcine-derived compound Bacillus alleviates piglet infection with porcine epidemic diarrhea virus by reshaping the intestinal barrier and microbial balance

　　

刘颖|范静辉|顾文远|赵云环|张帅|左玉珠

中国保定河北农业大学兽医学院

摘要

猪流行性腹泻病毒（PEDV）会导致哺乳仔猪严重的肠道损伤和高死亡率，从而造成全球性的经济损失。由于不断出现变异株，传统疫苗无法提供完全的保护。基于芽孢杆菌的益生菌因其安全性、稳定性和多功能生物活性而成为有前景的替代剂。本研究旨在探讨猪源复合芽孢杆菌在体外和体内对PEDV感染的保护作用及其机制。在IPEC-J2细胞中，猪源复合芽孢杆菌的培养上清液显著抑制了PEDV的复制，上调了抗病毒蛋白（ISG15、PKR、OAS1），并通过增加抗炎因子IL-4和减少促炎因子TNF-α来调节细胞因子的分泌。在PEDV感染的仔猪中，口服猪源复合芽孢杆菌有效缓解了临床症状，降低了腹泻评分和死亡率，减少了病毒排泄和组织中的病毒载量，修复了空肠黏膜结构，并通过上调紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）恢复了肠道屏障的完整性。同时，复合芽孢杆菌提高了肠道IgA水平，并重塑了被PEDV感染破坏的肠道微生物平衡。总体而言，猪源复合芽孢杆菌通过直接抗病毒作用、免疫调节、肠道屏障强化和微生物群调节等协同机制保护仔猪免受PEDV的侵害。本研究为开发猪源复合芽孢杆菌作为PEDV控制的绿色生物制剂提供了科学依据。

引言

冠状病毒是一类具有包膜的双链RNA病毒，具有较大的基因组和较高的突变率，能够感染多种哺乳动物和鸟类，引起各种呼吸系统、消化系统和神经系统疾病[1]。猪流行性腹泻（PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性、高度传染性的肠道疾病[2]。自20世纪70年代在欧洲首次发现以来，PEDV迅速在全球范围内传播，对养猪业构成了严重威胁[3]。PEDV主要侵入并在小肠上皮细胞中复制，导致绒毛严重萎缩、吸收不良、水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪的高死亡率[4]。尽管广泛接种了疫苗，但由于PEDV的高突变率和快速进化，免疫失败的情况仍然频繁发生，因此迫切需要开发安全、有效和环保的预防和控制策略[5,6]。

肠道微生物群在维持肠道稳态、营养吸收、免疫成熟和抵抗病原体方面起着关键作用[7]。益生菌可以通过调节微生物结构、增强肠道屏障功能和调节免疫反应来改善宿主健康[8]。近年来，越来越多的证据表明，多种益生菌，尤其是乳酸杆菌和芽孢杆菌菌株，对多种冠状病毒具有显著的抗病毒作用[9]。芽孢杆菌菌株因其形成孢子的能力而受到广泛关注，这使它们能够抵抗高温、酸、胆盐和恶劣的加工条件，使其非常适合工业生产和临床应用[10]。

我们之前的研究从健康仔猪中分离并筛选出了三种猪源菌株：Bacillus spizizenii K4、Bacillus subtilis E15和H16。这些菌株表现出优异的益生菌特性，包括促进生长的作用、耐受压力能力和初步的抗病毒潜力。因此，我们将这三种菌株结合在一起，制备了本研究中使用的猪源复合芽孢杆菌。基于我们之前的发现，即PEDV感染会破坏仔猪的肠道完整性和肠道微生物平衡，我们假设猪源复合芽孢杆菌可能通过抑制病毒复制、调节免疫反应、增强肠道屏障功能和恢复微生物平衡来保护仔猪免受PEDV的侵害。

因此，本研究使用IPEC-J2细胞模型和PEDV感染仔猪模型系统评估了猪源复合芽孢杆菌对PEDV的保护效果。探讨了其抗病毒作用、免疫调节、肠道屏障修复和微生物群调节的机制。本研究为开发猪源复合芽孢杆菌作为控制PEDV的新生物制剂提供了理论和实验支持。

章节片段

细胞、病毒和芽孢杆菌菌株

猪肠道上皮（IPEC-J2）细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养条件为37°C和5% CO₂的湿润培养箱。

Bacillus spizizenii K4和Bacillus subtilis E15、H16菌株之前已在我们的研究中分离、筛选并保存。我们在之前的研究中分离并鉴定的PEDV-WF/2023菌株属于G2a基因型，具有高度

猪源复合芽孢杆菌在IPEC-J2细胞中抑制PEDV复制

如图1A所示，该图示意了不同益生菌处理方法的机制。CCK-8细胞活力测试显示，E15、H16和K4菌株的上清液在适当稀释度下没有明显的细胞毒性（图1B、C、D）。对于E15和H16，所有1:2至1:32的稀释度在6-48小时内均无细胞毒性。对于K4，无毒稀释度范围为1:4至1:32。因此，E15和H16的最大无毒稀释度分别为1:2

讨论

猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的仔猪腹泻对全球养猪业构成了重大挑战。其高发病率和死亡率，尤其是在新生仔猪中，导致了巨大的经济损失，并严重影响了动物福利[13]。传统的疫苗预防方法受到PEDV变异株出现的限制[14]，而PEDV感染会严重破坏肠道微生物群——这是抵御肠道病原体的关键生物屏障[15]。使用三种

伦理批准和参与同意

河北农业大学的伦理委员会批准了这项动物研究，批准编号为2021069。该研究遵循了机构指南和当地法规。

出版同意

不适用。

资金支持

本研究得到了河北农业研究系统专项资金的支持（HBCT2024220201, HBCT2024220401）。

CRediT作者贡献声明

刘颖：正式分析、方法学、验证、可视化、撰写——初稿。范静辉：资金获取、资源提供、撰写——审阅与编辑。顾文远：研究工作、资源提供。赵云环：研究工作、验证。张帅：研究工作、验证。左玉珠：资金获取、资源提供、撰写——审阅与编辑。

研究人员声明与本研究、作者身份或论文发表无关的任何潜在利益冲突。

致谢

我们衷心感谢所有参与评审的专家以及为本研究提供帮助的所有人。