将外泌体通过化学物理方法负载到多孔钛表面上，以增强其与软组织的结合性能

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：Chemo-physical loading of exosomes on porous titanium for improved soft tissue integration

　　

邹丹|戴帆帆|周雪|杨萍|江朗|李莉

中国成都西华大学综合健康管理学院，610039

摘要

在牙科植入物周围建立持久的软组织密封层对于预防种植体周围炎至关重要，然而将外泌体高效地加载到钛表面上仍然具有挑战性。本研究开发了一种双功能涂层，该涂层通过化学物理加载策略将干细胞来源的外泌体与头孢噻肟钠结合在阳极氧化多孔钛表面上。在150伏特电压下，多孔钛表面有27%的孔径大于或等于150纳米，并且亲水性得到增强。通过化学物理方法加载的外泌体达到了最高的负载量（30.8微克/平方厘米），比单独使用化学接枝方法高出2.6倍，同时保持了生物活性。体外实验表明，多孔钛和外泌体修饰的表面促进了上皮细胞的粘附，并诱导出纺锤形的成纤维细胞形态。体内皮下植入实验显示，所有组别的生物相容性均良好，没有出现坏死或脓肿，纤维囊厚度也相当（约150微米）。所有测试的表面均未观察到不良的组织反应。这些发现表明，化学物理加载技术在优化的多孔钛表面上可以实现稳定且高容量的外泌体固定。这种双功能涂层同时促进了软组织细胞的反应，并提供了抗菌保护，为支持牙科植入物周围的组织愈合提供了一种有前景的策略。

引言

牙科植入物的长期成功在很大程度上取决于植入物材料与周围软组织之间建立持久的生物密封层，尤其是在黏膜转移部位。¹这种软组织密封层主要由上皮细胞附着和结缔组织整合构成，作为抵御口腔环境的主要屏障，防止细菌及其产物的侵入。未能快速形成紧密的密封层可能导致种植体周围黏膜炎症、上皮细胞向下生长，最终引发种植体周围炎，这是晚期植入物失败的主要原因之一。^{2, 3}因此，开发能够积极促进软组织整合的植入物表面非常重要。

近年来，细胞外囊泡，特别是外泌体，已成为组织工程和再生医学中具有前景的生物活性剂。⁴作为多种细胞分泌的天然纳米级囊泡，外泌体携带蛋白质、脂质和核酸， 在细胞间通讯中起着关键作用。它们能够调节免疫反应、促进细胞增殖和迁移以及胶原蛋白合成，使其成为增强组织再生的理想候选者。我们之前的研究还发现，间充质干细胞来源的外泌体（MSC-exo）的成分参与了组织修复的生物过程，包括蛋白质（VEGF、PDGF和多种细胞因子）和miRNA（miR-21-3p/5p、miR-125a-3p/5p、miR-let-7b-5p等），并且蛋白质-蛋白质相互作用网络分析和通路富集揭示了与组织再生相关的调控网络。⁵尽管MSC-exo注射通过减少氧化应激、调节免疫和促进血管生成来促进牙周组织再生，^{6, 7, 8, 9, 10}但由于需要考虑输送途径、生物行为、代谢动态特性、压力和渗透压等因素，注射方式限制了治疗效果。¹¹

用外泌体修饰植入物表面具有巨大的潜力，可以积极刺激周围的成纤维细胞和上皮细胞，从而加速软组织密封层的形成。¹²然而，将这一策略转化为实际的表面修饰技术面临重大挑战。主要障碍包括将外泌体高效地加载到钛表面上，确保其稳定保留，并实现持续释放以维持长期的生物活性效果。在金属基底上，外泌体加载方法主要包含简单的物理吸附^{13, 14}和化学接枝^{15, 16}。简单的物理吸附通常导致加载效率低和初始释放量过大，限制了治疗效果。¹⁷相反，化学接枝方法（如共价键合）可以提供稳定的附着，但连接剂可能会影响外泌体的性能。¹⁸此外，术后早期还存在感染风险。理想的生物活性表面不仅应促进组织整合，还应具有固有的抗菌特性，以防止在软组织成熟完成之前发生细菌定植。

因此，本研究提出了一种通过化学物理方法在多孔钛表面上加载外泌体的方法。首先制备了通过阳极氧化¹⁹而非整体处理²⁰得到的多孔钛表面，以便后续修饰，这可以提供较大的表面积^{13, 14, 17}，并与光滑模板相比增强细胞粘附²¹。然后，开发了一种结合化学接枝和二次物理加载的方法来提高负载能力，同时提供稳定的锚定。考虑到临床对感染控制的需求，进一步将头孢噻肟钠纳入这种外泌体涂层表面，以创建一种双功能涂层。本研究旨在提供一种有效的策略，用于工程化牙科植入物表面，以支持组织愈合并抵抗细菌感染（图1）。

章节摘录

外泌体的提取和表征

从大鼠（10天龄，Dossy，成都）的骨髓中提取间充质干细胞（MSC）。第三至第五代MSC在不含胎牛血清的DMEM/F12（Gibco，C11330500BT）培养基中培养24小时后，收集上清液。然后分别以1200转/分钟和3000转/分钟离心10分钟，再以16000克/分钟离心30分钟（4°C）。所得上清液与外泌体沉淀剂（上海XP Biomed有限公司，EX01）混合

高电压增加孔径

已知微粗糙或纳米粗糙的表面可以增强经皮植入物的亲水性，并促进细胞粘附和组织整合。在本研究中，通过调节施加的电压（从90伏特到150伏特），采用阳极氧化技术在钛表面上制备了这种粗糙表面。

如图2A所示，所有处理过的钛表面都表现出蜂窝状的多孔形态。具体来说，在90伏特（PT-90）和125伏特（PT-125）下制备的样品显示

讨论

在牙科植入物周围建立持久的软组织密封层仍然是一个关键的临床挑战，因为植入后的感染会破坏上皮屏障，导致种植体周围炎甚至植入物失败。^{27, 29}与天然牙齿不同，当前的植入物基台缺乏生物屏障，形成了容易受到细菌侵袭的脆弱界面。新兴证据强调了基于外泌体的疗法在牙周再生方面的潜力，因为外泌体富含

结论

本研究表明，在优化的多孔钛表面上采用化学物理加载技术可以实现稳定且高容量的外泌体固定，同时保持生物活性。所得的双功能涂层结合了MSC-exo和头孢噻肟钠，能够促进上皮细胞粘附和成纤维细胞活化，提供强大的抗菌保护，并在体内表现出良好的生物相容性。这些发现表明，P&C@exo-Cs涂层具有潜力

CRediT作者贡献声明

邹丹：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，资金获取，正式分析，数据管理。戴帆帆：撰写——初稿，方法学，数据管理。周雪：方法学，数据管理。杨萍：撰写——审稿与编辑，概念构思。江朗：监督，项目管理，方法学。李莉：撰写——审稿与编辑，可视化，监督，研究。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

作者在整个手稿的写作过程中没有使用AI。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了四川省科技计划（2025ZNSFSC1657）和西华大学的优秀人才项目（Z241029）的财政支持。