mIF示例。高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer, HGSOC）组织微阵列（tissue microarray, TMA）芯中经荧光标记的高亲和力结合肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）及细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）所显示的影像

《Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention》：mIF example. TMA core of an HGSOC ( A ) illuminated by fluorescence bound t... Open Access

　　

背景：既往研究发现，在高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer, HGSOC）的非西班牙裔黑人女性患者中，在肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）及细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）丰度的基础上加入空间分布信息可改善其与总生存期（overall survival, OS）的关联。本研究旨在以以非西班牙裔白人女性为主的HGSOC队列中验证上述发现。 方法：采用多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）表征433例HGSOC患者的TIL，基于置换法计算Ripley K函数评估TIL空间聚类，应用Cox比例风险模型分析空间聚类及丰度与OS的关联。 结果：在TIL高丰度（>1%）肿瘤中评估空间聚类差异时，研究人员发现空间信息显著改善近期活化CTL（recently activated CTL, CD3+CD8+CD69+）模型的拟合优度（似然比检验 P＝0.008）；其中高丰度低空间聚类的近期活化CTL相较于高丰度高空间聚类者死亡风险降低（风险比[hazard ratio, HR]＝0.31；95%置信区间[confidence interval, CI] 0.14–0.70；P＝0.004）。 结论：本研究证实了在主要为白人HGSOC女性人群中，纳入近期活化CTL的空间上下文信息可复制此前发现的与OS关联增强的现象。未来需进一步阐明近期活化CTL空间构象影响HGSOC生存的机制。 影响：本研究验证了此前结论——在生存分析中除丰度外加入空间上下文（尤指CTL或近期活化CTL）可改善模型拟合。

高级别浆液性卵巢癌肿瘤免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞空间聚类与总生存期关联的验证研究——《Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention》论文解读

一、研究背景与目的

高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer, HGSOC）是上皮性卵巢癌中最常见且致死率最高的亚型，晚期诊断普遍，现有治疗对多数患者疗效有限。已有研究表明肿瘤内存在肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL），尤其是细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL；CD3⁺CD8⁺）者总生存期（overall survival, OS）更长，且TIL位于肿瘤区而非间质区预后更佳，B细胞与CTL共定位亦与较好预后相关。然而既往分析多关注免疫细胞"丰度（abundance）"及"肿瘤/间质分区定位"，较少量化同一细胞表型或不同细胞表型间的"空间聚类（spatial clustering）/共定位"及其与预后的关系。研究人员此前在非洲裔美国人癌症流行病学研究（African American Cancer Epidemiology Study, AACES）非西班牙裔黑人HGSOC队列中发现：高丰度且低空间聚类的CTL与更好OS相关，且加入空间信息可显著改善模型拟合。本研究拟在护士健康研究（Nurses' Health Study, NHS；含NHS I与NHS II）及新英格兰病例对照研究（New England Case-Control Study, NECC）组成的以非西班牙裔白人女性为主的大型HGSOC队列（N＝433）中，复证TIL/CTL丰度联合空间聚类信息对OS关联模型的改善作用，并探讨空间架构对生存的预后价值。

二、主要技术方法概要

研究人员收集NHS I、NHS II及NECC研究中经病理确诊的HGSOC患者福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）组织，制作含3–6个芯（直径0.6 mm或1 mm）的组织微阵列（tissue microarray, TMA）。采用Opal 7-Color全自动mIF（multiplex immunofluorescence）试剂盒标记CD3、CD4、CD8、CD69、Foxp3及泛细胞角蛋白（pancytokeratin, 用于肿瘤/间质分割）与DAPI，Vectra 3系统采集图像，inForm软件做光谱解混，HALO软件进行细胞表型判定（限定肿瘤细胞区分析）。空间聚类采用R语言spatialTIME包（v1.2.1）基于置换法（100次置换）计算单变量及双变量Ripley K函数（半径r＝150像素≈75 μm），以观测值与完全空间随机下均值之差定义聚类程度，按中位数分为高/低聚类；TIL丰度按占总细胞数≤1%（低）或＞1%（高）及缺失分三类，组合为高丰度高聚类（HH）、高丰度低聚类（HL）、低丰度高聚类（LH）、低丰度低聚类（LL）及缺失五等级。生存分析采用Cox比例风险模型校正诊断年龄、分期、研究来源及CD3⁺百分比（T细胞亚群时），以似然比检验（likelihood ratio test, LRT）比较仅含丰度模型与含丰度＋空间信息模型拟合优度，显著性阈值取P＜0.01以校正多重检验，敏感性分析限定非西班牙裔白人及剔除蜡块保存超30年标本。

三、研究结果

核心水平——单免疫细胞表型空间聚类与生存（Association of single-cell type spatial clustering with survival）

对所有T细胞表型五分类（缺失/HH/HL/LH/LL）Cox模型整体未显著优于仅含临床变量及CD3丰度的模型。但在近期活化CTL（CD3⁺CD8⁺CD69⁺）高丰度（＞1%）亚组中，加入空间聚类水平显著改善模型拟合（LRT P＝0.003）；与高丰度高聚类（HH）相比，高丰度低聚类（HL）的近期活化CTL对应死亡风险显著降低（HR＝0.31；95% CI 0.14–0.70；P＝0.004），即肿瘤内近期活化CTL数量多且呈弥散分布（低聚类）者OS更优。一般CTL（CD3⁺CD8⁺）在高丰度亚组中加入空间信息亦有模型拟合改善趋势（LRT P＝0.045），HL组较HH组呈生存优势趋势（HR＝0.66；95% CI 0.44–0.99；P＝0.044）。其余T细胞亚群（总CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD4⁺CD69⁺、CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞[regulatory T cell, Treg]）未见空间信息显著改善模型拟合。

共定位分析与生存（Association of colocalization with survival）

评估CTL或近期活化CTL与辅助T细胞（Th；CD3⁺CD4⁺）、近期活化Th（CD3⁺CD4⁺CD69⁺）、Treg（CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺）的双变量Ripley K共定位，各组合未达P＜0.01显著性，近期活化CTL与Th细胞共定位模型拟合改善相对最大（LRT P＝0.054），在双细胞均存在的样本中低共定位与高共定位比较未达显著差异。其余共定位组合无显著模型改善。

敏感性分析（Sensitivity analysis）

限定非西班牙裔白人及剔除保存＞30年蜡块样本后，主结论保持一致；非西班牙裔白人亚组中一般CTL加入空间信息较全队列更明显改善拟合（LRT P＝0.001），近期活化CTL相应分析LRT P＝0.010及P＝0.017仍具统计学意义。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出，本研究在主要为非西班牙裔白人HGSOC人群部分验证了既往非西班牙裔黑人所见现象——高丰度且低空间聚类的CTL（尤其是近期活化CTL，CD3⁺CD8⁺CD69⁺）与较好OS关联，且空间信息补充丰度信息可改善Cox模型拟合（近期活化CTL：LRT P＝0.008；高丰度亚组LRT P＝0.003）。弥散分布模式可能反映更广泛的抗肿瘤免疫应答。种族间核心趋势相似提示T细胞空间聚类非HGSOC生存种族差异的主要驱动因素。局限性含TMA取样局限、Ripley K搜索半径预设及罕见T细胞亚型统计效能不足。研究强调未来需在更大队列结合更多免疫标志物及其他空间分析方法，探索TIME空间架构作为HGSOC预后生物标志物的潜力。

结论（翻译自原文Conclusions与Impact）：

在本研究中，研究人员于以白人为主的HGSOC女性群体中复现了先前发现——将近期活化CTL的空间上下文信息加入丰度分析可显著改善其与总生存期的关联。需进一步研究近期活化CTL空间架构影响HGSOC生存的机制。本研究的启示为：在生存分析中除免疫细胞丰度外纳入空间上下文（尤其针对CTL或近期活化CTL），可改善模型拟合，支持开发同时考虑肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）中免疫细胞丰度与空间分布的HGSOC预后生物标志物。