单细胞类型生存分析：基于单细胞聚类的生存曲线研究

《Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention》：Single-cell type survival. Single-cell clustering survival curves in which ... Open Access

　　

背景：既往研究发现，在非西班牙裔黑人高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）女性中，将肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TIL）和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTL）的空间背景纳入其丰度评估后，可增强其与总生存期（overall survival, OS）的相关性。本研究旨在主要由非西班牙裔白人女性构成的HGSOC队列中重复验证既往发现。方法：采用多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）对来自3项流行病学研究入组女性的HGSOC样本中的TIL进行表征（N = 433）。应用基于Ripley K的置换方法推导TIL的空间聚类特征。采用Cox比例风险模型分析空间聚类与丰度和OS之间的关联。结果：在评估TIL高丰度（>1%）肿瘤内空间聚类差异的模型中，研究人员发现，对于近期活化CTL，空间信息可显著改善模型拟合（似然比检验 P = 0.008）；其中，与近期活化CTL高度聚类相比，高丰度但低空间聚类与死亡风险下降相关（风险比 = 0.31；95%置信区间，0.14–0.70；P = 0.004）。结论：本研究在以白人女性为主的HGSOC人群中重复验证了既往结果，即纳入近期活化CTL的空间信息可显著增强其与OS的关联。仍需进一步研究以阐明近期活化细胞空间结构影响HGSOC生存的机制。影响：本研究验证了研究人员此前的发现，即在生存分析中，将空间背景纳入细胞丰度信息，尤其是针对CTL或近期活化CTL，可改善模型拟合效果。

该文发表于《Cancer Epidemiology, Biomarkers 》。研究聚焦于高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer, HGSOC）肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）中T细胞空间结构与患者总生存期（overall survival, OS）的关系。卵巢癌是美国女性癌症相关死亡的重要原因之一，其中HGSOC是最常见且致死负担最高的上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）亚型。由于症状缺乏特异性，HGSOC多在晚期确诊。尽管聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂、抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）治疗以及程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）免疫检查点抑制剂已带来一定治疗进展，但总体生存获益仍较有限，仅有部分患者获益。因此，寻找能够更准确反映肿瘤免疫状态并与预后相关的组织学标志物，具有重要临床意义。

既往研究已经表明，HGSOC肿瘤中存在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）通常提示更长的无进展生存和更好的总生存。然而，单纯评估免疫细胞丰度并不足以完整反映抗肿瘤免疫反应的组织结构特征。越来越多证据显示，TIL所在的空间位置、与肿瘤区室的关系以及不同免疫细胞之间的邻近模式，均可能影响其生物学功能。例如，位于肿瘤区而非间质区的细胞毒性T淋巴细胞（CTL；CD3⁺CD8⁺）与更好的OS相关；B细胞与CTL的近距离共定位也被报道与卵巢癌特异生存改善有关。尽管如此，EOC中免疫细胞“细胞—细胞聚类”与生存的关系仍研究不足，空间分析往往局限于肿瘤/间质定位，而非更精细的聚类结构。基于这一问题，研究人员尝试在传统丰度指标之外，引入单细胞空间聚类信息，以更系统地刻画TIME并评估其预后价值。

本研究的直接动因来自研究团队此前在非西班牙裔黑人HGSOC女性中的发现：CTL和TIL若呈现“高丰度、低空间聚类”模式，则与更好的OS相关；并且将空间信息纳入模型后，较仅使用丰度信息能够更显著改善模型拟合。当前研究进一步在以非西班牙裔白人女性为主的独立人群中检验这一结论的可重复性，以评估该空间免疫学特征是否具有更广泛的外部适用性。

在研究设计上，研究人员整合了3个大型流行病学研究队列，即Nurses’ Health Study I（NHSI）、Nurses’ Health Study II（NHSII）和New England Case-Control Study（NECC），共纳入433例HGSOC患者、1,244个组织芯片（tissue microarray, TMA）核心。所有病例均经妇科病理学家复核，确认分期、分级、组织学类型及肿瘤区域。研究者对福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）肿瘤组织构建TMA，并采用多重免疫荧光（mIF）检测CD3、CD4、CD8、CD69和FOXP3等T细胞相关标志物，从而定义总T细胞、辅助性T细胞（Th cells）、CTL、调节性T细胞（Tregs）以及近期活化T细胞亚群。全部分析均限定在肿瘤区室内进行，以降低不同区室差异带来的混杂。

方法学上，研究的核心创新是空间聚类定量。研究人员利用Ripley K统计量，并在r = 150像素（约75 μm）半径下计算单一细胞表型聚类及双细胞表型共定位程度。针对TMA核心中存在无细胞空洞的问题，研究团队采用基于完全空间随机（complete spatial randomness, CSR）假设的置换方法估计经验分布，以“观测Ripley K减去CSR下Ripley K均值”的方式定义空间聚类程度。每位患者若有多个核心，则取平均值用于后续生存分析。空间聚类按中位数划分为高、低两级；细胞丰度则分为缺失、低丰度（≤1%）和高丰度（>1%），从而构建五分类变量：缺失、低丰度/低聚类、低丰度/高聚类、高丰度/低聚类、高丰度/高聚类。统计分析使用Cox比例风险模型，校正诊断年龄、诊断年份、分期及研究队列；T细胞亚群分析进一步校正CD3⁺细胞比例。若分析双细胞共定位，则比较CTL或近期活化CTL与Th细胞、Tregs及近期活化Th细胞之间的空间关系。

就主要技术方法而言，本研究主要采用了以下策略：其一，基于NHSI、NHSII和NECC三项流行病学队列收集HGSOC病例及临床随访信息；其二，利用TMA结合mIF对肿瘤区室内T细胞标志物进行单细胞层面表型识别；其三，应用基于置换的Ripley K方法量化单细胞聚类和双细胞共定位；其四，采用Cox比例风险模型和似然比检验（likelihood ratio test, LRT）比较仅含丰度信息与同时纳入空间信息模型的拟合优度，从而评估空间结构对OS预测的增益。

研究结果部分首先报告了核心水平的细胞丰度特征。CD3标志物在90%以上TMA核心中为阳性，且83.9%的核心具有足够阳性细胞用于空间聚类计算，是各类标志中可分析比例最高者。CTL和近期活化CTL的阳性比例分别为75.6%和60.5%，可用于聚类分析的比例分别为65.8%和49.4%。相比之下，Th细胞、近期活化Th细胞及Tregs的丰度更低，限制了部分分析的统计效能。

在“Association of single-cell type spatial clustering with survival”部分，研究人员首先考察单细胞类型空间聚类与生存的关系。总体而言，对于所有检测的标志组合，包含五级“丰度/空间聚类”变量的模型，相较仅含临床信息及必要时CD3丰度的模型，并未在预设显著性阈值P < 0.01下显示出统计学显著改进。不过，从趋势上看，CTL及近期活化CTL是最接近显著的亚群，提示其空间结构可能具有更高预后相关性。

进一步在“高丰度样本”中分层分析后，结果更加明确。对于肿瘤内近期活化CTL丰度大于1%的病例，加入空间聚类信息后，模型拟合显著改善（LRT P = 0.003）；若进一步比较“仅丰度模型”与“丰度+空间信息模型”，空间信息的加入同样显著改善拟合（P = 0.008）。在这一亚群中，近期活化CTL呈高丰度但低聚类分布的患者，其死亡风险显著低于高丰度且高聚类者，HR = 0.31，95%置信区间为0.14–0.70，P = 0.004。这一发现构成全文最核心的结果，且与研究团队既往在非西班牙裔黑人HGSOC中的观察相一致。相比之下，Th细胞和近期活化Th细胞纳入聚类信息后并未改善模型表现。

在“Association of colocalization with survival”部分，研究人员检验了双细胞共定位与OS之间的关系，包括CTL与Th细胞、Tregs、近期活化Th细胞，以及近期活化CTL与Th细胞、近期活化Th细胞的组合。结果显示，所有五级“丰度/共定位”模型均未达到预设的P < 0.01显著性标准。改善趋势最明显的是近期活化CTL与Th细胞的共定位，但其LRT P值为0.054，仍未达到统计学显著标准。在仅限两类细胞均存在且可计算共定位的样本中，共定位程度高低同样未显著改善模型拟合。由此可见，本研究未能证实双细胞共定位在该队列中对HGSOC总生存具有独立而稳健的预测价值。

在“Sensitivity analysis”部分，研究人员进行了两类敏感性分析：一是限制为非西班牙裔白人患者，二是剔除采样时间距离检测超过30年的样本，以减少抗原性衰减的潜在影响。结果表明，主要发现整体保持稳定，未见实质性改变。在仅限非西班牙裔白人样本时，CTL模型中加入丰度与空间背景相较仅使用丰度可改善拟合，但对于近期活化CTL相关模型，其空间效应P值较全样本略大，提示种族构成和样本条件可能会影响效应大小，但不改变总体趋势。

讨论部分指出，HGSOC预后不良，而TIME空间结构与生存之间的联系仍知之甚少。本研究在以非西班牙裔白人为主的最大规模HGSOC T细胞空间聚类研究中，未观察到与既往黑人队列同等广泛而显著的关联，但成功重复了一个关键现象：对于近期活化CTL，在高丰度背景下，低空间聚类与更优OS相关，且空间信息确实能够提升生存模型拟合。研究人员据此认为，CTL相关空间聚类可能并不是解释不同种族HGSOC生存差异的主要因素。

作者进一步讨论了可能的生物学解释。TIL和CTL在肿瘤中的浸润已被公认为良好预后的指标，而空间上更弥散、低聚类的CTL/TIL分布，可能代表更广泛的全肿瘤抗肿瘤免疫应答。另一个可能性是，空间结构本身是整体TIME构筑差异的替代指标，反映免疫反应状态或肿瘤发育过程。研究同时指出，未观察到更强关联也可能与统计效能不足、稀有T细胞亚群数量有限、搜索半径预设未必最优等因素有关。因此，未来需要在更大队列中，结合更多免疫标志物面板及其他空间分析方法，进一步研究不同T细胞亚群在肿瘤、间质及血管周围的空间分布特征。

本研究的意义在于支持将“细胞丰度+空间背景”作为HGSOC预后生物标志物开发的方向，而非仅依赖细胞丰度。尤其是近期活化CTL的空间分布，可能为生存风险分层提供补充信息，并为未来将组织活检中的空间免疫特征用于临床试验分层或预后评估奠定基础。

结论部分可译为：总之，本研究支持在HGSOC预后生物标志物的开发中，同时考虑TIME内免疫细胞的丰度与空间背景，而不仅仅依赖丰度信息。