高级别浆液性卵巢癌中肿瘤浸润淋巴细胞及近期活化细胞毒T淋巴细胞的空间聚类与总生存期的关联：空间信息改善生存模型拟合度的验证研究

《Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention》：Colocalization survival. Colocalization degree of clustering survival curve... Open Access

　　

背景：既往研究发现，在高分级浆液性卵巢癌（high?grade serous ovarian cancer, HGSOC）的非西班牙裔黑人女性队列中，将肿瘤浸润淋巴细胞（tumor?infiltrating lymphocyte, TIL）和细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL；CD3+CD8+）的空间背景信息加入其丰度分析中可改善与总生存期（overall survival, OS）的关联。本研究旨在以主要为非西班牙裔白人女性的HGSOC队列验证上述发现。 方法：采用多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）表征433例来自三项流行病学研究的HGSOC患者肿瘤中TIL的空间分布，使用置换法计算Ripley K函数的空间聚类程度，采用Cox比例风险模型分析空间聚类与丰度对OS的影响。 结果：在TIL高丰度（＞1％）肿瘤中评估空间聚类差异的模型显示，近期活化CTL（CD3+CD8+CD69+）的空间信息显著改善模型拟合度（似然比检验P＝0.008）；其中高丰度低空间聚类的近期活化CTL相较于高丰度高空间聚类者死亡风险降低（风险比[hazard ratio, HR]＝0.31；95％置信区间[confidence interval, CI]：0.14–0.70；P＝0.004）。 结论：本研究在主要为白人HGSOC女性人群中复制出既往结果——纳入近期活化CTL的空间信息可显著改善其与OS的关联。进一步需探究近期活化免疫细胞空间架构影响HGSOC生存的机制。 意义：研究验证了此前结论，即在生存分析中，将空间背景（尤其是CTL或近期活化CTL的空间分布）叠加于丰度之上可改善模型拟合度。

论文解读：《Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention》发表——高级别浆液性卵巢癌中TIL及近期活化CTL空间聚类与总生存期关联的验证研究

研究背景

卵巢上皮性癌特别是高级别浆液性卵巢癌（high?grade serous ovarian cancer, HGSOC）预后差，现有治疗对多数患者生存改善有限。已有研究表明肿瘤浸润淋巴细胞（tumor?infiltrating lymphocyte, TIL）尤其是细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL；CD3⁺CD8⁺）丰度高与较好总生存期（overall survival, OS）相关，且CTL定位于肿瘤区而非间质更具预后价值；亦有研究提示B细胞与CTL共定位（colocalization）与较好预后有关。但免疫细胞在肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）中的空间聚类模式（而非仅区室定位或单纯丰度）与HGSOC生存的关系尚不清楚。研究人员前期在非西班牙裔黑人HGSOC队列中发现，高丰度且低空间聚类的CTL与更好OS相关，且在Cox模型中加入空间信息较仅用丰度可改善拟合。本研究旨在以主要为非西班牙裔白人女性的大型HGSOC队列重复并验证该发现，明确空间上下文（spatial context）叠加于免疫细胞丰度是否普遍提升生存模型的解释力。

主要关键技术方法

研究人员利用三项流行病学队列——护士健康研究Ⅰ（Nurses' Health Study I, NHSI）、护士健康研究Ⅱ（NHSII）和新英格兰病例对照研究（New England Case?Control Study, NECC）——共433例经病理确认FIGO Ⅰ–Ⅳ期HGSOC患者的福尔马林固定石蜡包埋（formalin?fixed paraffin?embedded, FFPE）标本制作组织微阵列（tissue microarray, TMA），采用Opal 7色多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）标记CD3、CD4、CD8、CD69、Foxp3及细胞角蛋白（pan?cytokeratin）区分肿瘤/间质区，经inForm和HALO软件进行光谱解混与细胞表型判定。使用R包spatialTIME基于置换法（100次置换）计算单类细胞表型及两类细胞表型的双变量Ripley K函数（半径r≈75 μm）量化空间自聚类（spatial clustering）与共定位（colocalization）程度，按完全空间随机性（complete spatial randomness, CSR）期望校正后取同病例多芯平均值。按中位值将聚类程度划为高/低，按TIL占肿瘤细胞总数1%划为高/低丰度构建五分类变量。采用Cox比例风险模型校正确诊年龄、诊断年份、分期（Ⅰ/Ⅱ vs Ⅲ/Ⅳ）及研究来源，T细胞亚群额外校正CD3⁺占比，以似然比检验（likelihood ratio test, LRT）比较仅含丰度模型与含丰度＋空间信息模型拟合优度，显著性阈值取P＜0.01以校正多重检验，并行非西班牙裔白人限定及样本采集年代敏感性分析。

研究结果

Association of single?cell type spatial clustering with survival（单细胞表型空间聚类与生存的关联）

在全样本五水平Cox模型中，多数免疫细胞表型（总T细胞CD3⁺、Th细胞CD3⁺CD4⁺、Treg CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺、近期活化Th CD3⁺CD4⁺CD69⁺、普通CTL CD3⁺CD8⁺、近期活化CTL CD3⁺CD8⁺CD69⁺）的空间＋丰度模型较仅临床＋CD3丰度模型未见显著优于P＜0.01水平的LRT改善；其中近期活化CTL显示出最大的模型拟合改善趋势（LRT P＝0.025，未达严格显著性）。但在限定高丰度（＞1%）样本中分析空间聚类差异时，近期活化CTL的空间信息显著改善模型（LRT P＝0.003），且高丰度低空间聚类组相比高丰度高空间聚类参照组死亡风险显著降低（HR＝0.31；95%CI：0.14–0.70；P＝0.004）；将五水平（含丰度与空间）模型与仅三水平丰度模型比较也显著改善拟合（LRT P＝0.008）。普通CTL在高丰度亚组中也显示空间信息具边际改善作用（LRT P＝0.045），高丰度低聚类呈较好生存趋势（HR＝0.66；95%CI：0.44–0.99；P＝0.044）。其余T细胞亚群在高丰度亚组中无显著空间效应。

Association of colocalization with survival（两种细胞表型共定位与生存的关联）

对CTL或近期活化CTL分别与Th、近期活化Th、Treg的双变量共定位分析，五水平（缺席/单方存在/双方存在＋高或低共定位）Cox模型整体未达到P＜0.01显著性；近期活化CTL与Th细胞（CD3⁺CD4⁺）共定位模型改善趋势最大（LRT P＝0.054）。在双方细胞均存在可计算共定位的样本中，低共定位与高共定位相比未达显著生存差异（LRT P＞0.019）。其余细胞对共定位分析亦无显著模型改善（LRT P＞0.126）。

Sensitivity analyses for sample age and race（按种族与样本年代的敏感性分析）

限定为非西班牙裔白人女性后主要结果方向一致；排除距检测超过30年收集的标本结果仍相似。非西班牙裔白人中普通CTL的空间＋丰度模型较仅丰度模型拟合改善达LRT P＝0.001（全样本为P＝0.033），近期活化CTL高丰度亚组空间差异及空间信息贡献的LRT P分别为0.010和0.017，略弱于全样本但不改变结论趋势。

讨论与结论翻译

研究人员此前报道非西班牙裔黑人HGSOC患者中肿瘤区TIL/CTL高丰度且低空间聚类与较好OS相关，加入空间背景可改善模型拟合。本以主要为非西班牙裔白人HGSOC人群的研究虽总体显著关联较少（可能源于批次效应、队列种族构成差异或检验效能），但在高丰度亚组中近期活化CTL（CD3⁺CD8⁺CD69⁺）空间信息仍显著改善Cox模型（LRT P＝0.003），且加入空间信息较仅用丰度模型拟合显著更优（LRT P＝0.008），与非西班牙裔黑人队列趋势吻合，提示CTL空间聚类模式并非HGSOC生存种族差异的主因。低空间聚类可能反映CTL在肿瘤内弥散分布，暗示更广泛的抗肿瘤免疫应答。此为迄今最大规模对非西班牙裔白人HGSOC肿瘤区T细胞空间聚类程度表征及其与OS关联的评价研究，结果支持在HGSOC预后生物标志物开发中兼顾免疫细胞丰度与TIME中空间背景信息。

原文结论部分翻译：

在本研究中，研究人员验证了在多为白人HGSOC女性中，将近期活化CTL的空间信息纳入分析可显著改善其与总生存期（OS）的关联，重现了此前的发现。尚需进一步研究阐明近期活化免疫细胞空间架构影响HGSOC生存的机制。本研究证实了先前结论——在生存分析中把空间背景（尤其CTL或近期活化CTL的空间分布）加入丰度信息可改善模型拟合度。