从进口肉牛中分离的含质粒携带型mcr-4.3的**Acinetobacter nosocomialis**（鲍曼不动杆菌复合群成员）：基因组特征与One Health启示

《One Health》：Plasmid-borne mcr-4.3 in Acinetobacter nosocomialis recovered from imported beef cattle: Genomic characterization and one health implications

　　

移动型多黏菌素耐药决定因子在临床相关**Acinetobacter**属物种中的出现对抗菌药物管理（Antimicrobial Stewardship）和One Health监测构成日益严峻的挑战。尽管mcr-4.3已在**Acinetobacter**属中有报道，但其在进口食用动物中的发生情况及其更广泛的系统发育基因组学背景仍不明确。研究人员对150头自澳大利亚进口至中国的肉牛粪便样本进行了调查。经选择性培养分离的**Acinetobacter**菌株接受了全基因组测序，其中mcr-4.3阳性菌株进一步通过短读长与长读长测序的混合组装进行解析。利用已公开发表的**A. nosocomialis**基因组数据进行了比较质粒分析和全球系统发育基因组学分析。在从进口牛中分离的54株**Acinetobacter**菌株中，一株**A. nosocomialis**（菌株NB148）携带mcr-4.3。全基因组测序显示mcr-4.3位于一个28,233 bp的质粒上，命名为pNB148\_mcr-4.3，该质粒携带质粒维持相关的毒素-抗毒素系统（Toxin-Antitoxin Systems, TA），并与先前报道的**Acinetobacter**物种携带mcr-4.3的质粒具有显著的骨架相似性。mcr-4.3区域位于一个假定重组酶和一个Tn3家族转座酶下游，提示该耐药决定因子存在保守的遗传框架。纳入574株已公开发表**A. nosocomialis**基因组的全球系统发育基因组学分析将NB148置于一个跨越动物、环境和人类来源的多样化国际种群中。在全球菌株集合中，11株基因组携带mcr-4.3，其中10株属于ST279，表明该谱系可能是mcr-4.3阳性**A. nosocomialis**持续存在和国际传播的重要基因组背景。本研究首次报道了从进口肉牛中分离的**A. nosocomialis**携带质粒型mcr-4.3，并将这一发现置于更广泛的国际One Health背景中。研究数据拓展了mcr-4.3阳性**A. nosocomialis**已知的生态范围，并支持在动物-人类-环境界面，特别是在进口和边境检疫环节加强基因组监测。

研究背景与问题提出。多药耐药（Multidrug Resistance, MDR）病原菌的威胁日益严峻，其中**Acinetobacter nosocomialis**作为重要的机会性病原菌，在医疗机构和免疫抑制患者中引起严重感染。由于治疗选择有限，多黏菌素（Colistin）常被视为"最后手段"抗生素。然而，质粒介导的多黏菌素耐药基因（mcr，mobilized colistin resistance）的全球扩散严重削弱了该药物的临床效力。mcr-4.3作为mcr-4的变体，因两个特异性氨基酸替换（V179G和V236F）而与mcr-4区分，自2014年在人临床标本的**Enterobacter cloacae**中首次检出以来，已在**A. nosocomialis**、**A. baumannii**、**Enterobacter kobei**和**Leclercia adecarboxylata**等多种临床重要病原菌中被发现。尽管mcr-4.3在动物源细菌中的检出提示动物可能作为潜在储存库，但其在进口食用动物中的发生情况及基因组特征尚不明确，特别是国际活畜贸易是否可能成为引入mcr-4.3携带菌的直接途径缺乏具体数据。这一知识空白限制了One Health框架下针对抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）跨境传播的精准防控。

研究设计与方法。为填补上述空白，研究人员于2019年9月从澳大利亚进口至中国宁波港的150头肉牛粪便样本中，通过增菌培养和选择性平板筛选获得54株**Acinetobacter**菌株。经MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定及平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity, ANI）分析，确认其中11株为**A. nosocomialis**。所有菌株均进行Illumina NovaSeq 6000短读长全基因组测序，对mcr-4.3阳性菌株NB148额外进行Oxford Nanopore MinION长读长测序，采用Unicycler软件进行混合组装以获得完整基因组。抗微生物药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST）采用标准琼脂稀释法和肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。生物信息学分析利用ABRicate软件比对ResFinder和PlasmidFinder数据库以鉴定耐药基因和质粒复制子类型，并通过BLASTn解析mcr-4.3的遗传环境。为将NB148置于全球背景，研究人员从NCBI Assembly数据库获取574株**A. nosocomialis**基因组，采用Snippy进行核心基因组单核苷酸多态性（Core-genome Single Nucleotide Polymorphism, SNP）分析，以Gubbins过滤重组区域后构建最大似然进化树，并通过PubMLST确定多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）。

主要研究结果。菌株分离与鉴定结果显示，从进口牛粪便中分离的**A. nosocomialis**菌株NB148携带质粒型mcr-4.3，对多黏菌素B的MIC为8 mg/L，同时对哌拉西林/他唑巴坦耐药，但对多种其他类别抗生素保持敏感。

完整基因组与质粒特征分析显示，NB148的完整基因组包含一条3,898,347 bp的环状染色体和三个质粒。mcr-4.3位于28,233 bp的质粒pNB148\_mcr-4.3上，该质粒未能被PlasmidFinder分配至已知复制子类型，但携带RepB家族RepM蛋白，与南非临床**A. nosocomialis**分离株中的pCAC13a质粒类型一致。质粒含有两个II型毒素-抗毒素系统（PhD/YefM和RelE/ParE），与质粒稳定性和持续存在相关。mcr-4.3基因上游为假定重组酶和Tn3家族转座酶（ISPsy42），下游无移动遗传元素，形成与其他已表征mcr-4.3遗传环境一致的结构。

全球系统发育基因组学分析表明，NB148与来自马来西亚（2015年）的人源菌株聚类接近，与中国大多数本地菌株系统发育关系较远。进化树呈现动物、环境和人类来源菌株在国家间的广泛混合，无明确地理聚类，提示**A. nosocomialis**的全球传播主要由移动遗传元素介导的跨生态边界水平基因转移驱动，而非特定地理克隆的扩张。

全球分布与序列型分析通过Sankey图展示了590株**A. nosocomialis**（本研究16株，公共数据库574株）在地理来源、序列型（ST）和分离来源间的复杂流行病学关联。菌株来自23个国家，主要集中在美国（184株）、中国（179株）和日本（48株）。MLST分析揭示ST410、ST433、ST71、ST768、ST279、ST68等多种ST型，其中ST279在mcr-4.3阳性菌株中占主导地位，且存在于动物、环境和人类来源，显示广泛的宿主范围。

mcr-4.3阳性菌株的国际分布与亲缘关系分析发现，全球共12株mcr-4.3阳性**A. nosocomialis**，来自韩国、泰国、南非和中国四个地理区域，涵盖环境、动物和人类三种来源类型。其中10株为ST279，1株为ST322；8株来自韩国（7株环境来源，1株动物来源），其余3株分别来自泰国、南非和台湾地区的人源病例。核心基因组SNP分析显示，泰国、南非和台湾地区的3株人源菌株与韩国主要环境簇的差异≤200个SNP，支持存在密切关联的国际簇；而NB148与该主要簇差异约2000个SNP，虽同属ST279，但遗传距离较远。这一发现表明ST279可能是mcr-4.3携带的共有基因组背景，但其全球传播并非由单一高度克隆化谱系驱动，而是通过mcr-4.3携带质粒在不同ST279菌株间的水平转移实现。此外，台湾地区菌株携带独特的fusA基因突变，其对抗生素耐药的功能相关性有待确定。

结论与意义。该研究首次报道了从进口肉牛中分离的**A. nosocomialis**携带质粒型mcr-4.3，并通过完整的基因组特征和全球系统发育基因组学分析将其置于国际One Health背景中。研究证实mcr-4.3位于携带保守毒素-抗毒素系统和转座关联遗传环境的质粒上，提示其在**Acinetobacter**质粒背景中的持续存在机制。全球分析表明mcr-4.3阳性**A. nosocomialis**虽仍属少见，但已分布于多个地区和来源类型，且多数现有基因组属于ST279。这些发现拓展了该耐药决定因子已知的生态范围，为将进口食用动物纳入边境相关One Health监测以检测临床相关抗菌药物耐药基因的跨境传播提供了基因组学证据，支持在动物-人类-环境界面加强协调监测的紧迫性。