健脾方缓解围产期损伤模型子代社交缺陷、肠道菌群失调及髓鞘形成不足

《Pediatrics & Neonatology》：Spleen-tonifying formula alleviates social deficits, gut dysbiosis, and hypomyelination in a perinatal injury model

　　

背景：已有研究表明围产期损伤可诱导子代出现自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）样表型，包括社交行为缺陷、髓鞘形成不足（Hypomyelination）及肠道微生物失衡。健脾方（Spleen-tonifying Formulas, STFs）源于中医药，被证实可调节脑?肠轴（Brain–Gut Axis），尤其在母体免疫激活诱导的围产期损伤子代中可改善髓鞘形成不足与微生物失调。然而，STF是否能改善此类围产期损伤子代的行为缺陷尚不清楚。方法：研究人员采用宫内脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）暴露联合生后缺氧应激建立的"二次打击（Two-hit）"围产期损伤大鼠模型，评估STF的治疗效应。从子代6周龄起每日经口给予STF提取物或蒸馏水，持续14天后进行三箱社交互作、理毛（Grooming）、转棒（Rotarod）及开场（Open-field）等行为学测试。通过免疫组织化学检测前额叶皮层髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）及少突胶质细胞密度；采用16S rRNA基因测序分析粪便菌群组成；并在人少突胶质瘤（Human Oligodendroglioma, HOG）细胞中进行体外氧化应激实验。结果：STF处理显著改善围产期损伤子代的社交行为并恢复髓鞘形成，表现为前额叶皮层MBP表达增加及Olig2+（成熟少突胶质细胞）和NG2+（少突胶质前体细胞）细胞数量升高。体外实验显示STF通过维持AKT活化并抑制ERK信号，保护分化HOG细胞免受H2O2诱导的氧化应激与死亡。肠道菌群分析表明STF有效改善菌群失调，尤其富集Oscillospiraceae科和Colidextribacter属，其丰度与社会交往改善呈正相关，提示可作为治疗反应的潜在生物标志物。结论：口服STF与围产期损伤子代社交行为改善、髓鞘形成恢复及肠道微生物组成调节相关，提示未来需进一步阐明上述结局间的潜在因果关系。

论文解读：健脾方缓解围产期损伤模型子代社交缺陷、肠道菌群失调及髓鞘形成不足

研究背景与立项依据

围产期脑损伤——尤指发育关键窗口期遭受多重打击——是远期神经发育障碍的重要危险因素。围产期炎症参与自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）发生，ASD典型表现为社交与交流缺陷及重复刻板行为。ASD患者脑内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）与脂质过氧化水平升高，前额叶皮质（Prefrontal Cortex, PFC）活动低下并存在髓鞘形成不足（Hypomyelination），与执行功能障碍相关；啮齿类炎症模型中氧化应激可降低少突胶质细胞髓鞘相关基因及蛋白表达。同时，肠道微生物失调（Dysbiosis）与ASD发病密切相关，菌群代谢产物可影响脑炎症及神经传递系统，菌群移植或益生菌干预可一定程度减轻ASD行为严重程度，提示调控 microbiota-gut-brain axis（菌?肠?脑轴）具治疗潜力。既往研究发现含茯苓、酸枣仁及蘑菇提取物的健脾方（Spleen-tonifying Formula, STF）"KI essence"在LPS诱导母体免疫激活模型中具抗氧化、调节菌群及减轻髓鞘形成不足作用，但未验证其行为改善效果。鉴于ASD患儿常辨证为心脾两虚（Heart–Spleen Deficiency），研究人员优化经典补益心脾方药组成（含茯苓 Poria cocos、白术 Atractylodis macrocephala、甘草 Glycyrrhiza uralensis、生姜 Zingiber officinale、陈皮 Citrus reticulata、酸枣仁 Ziziphus jujuba var. spinosa），探讨其对围产期二次打击损伤子代行为、髓鞘及菌群的影响，论文发表于《Pediatrics》。

主要关键技术方法概述

研究人员建立孕鼠妊娠第17、18天腹腔注射LPS（100 μg/kg）联合子代生后缺氧应激的二次打击围产期损伤Wistar大鼠模型，子代6周龄起经口给予STF提取物（200 mg/kg）或水对照，连续14天。采用三箱社交互作测试社交偏好、理毛测试重复行为、转棒测试运动协调、开场测试总体活动与焦虑样行为。灌注取脑后行前额叶皮层MBP免疫组化染色及Olig2、NG2免疫荧光标记少突胶质细胞谱系，用图像分析软件定量。收集新鲜粪便行16S rRNA基因V3–V4区Illumina MiSeq测序，经DADA2流程及SILVA数据库注释进行α/β多样性及LEfSe差异丰度分析。体外培养人少突胶质瘤（Human Oligodendroglioma, HOG）细胞，用N2 Supplement诱导分化后用H₂O₂（200 μM）诱导氧化损伤，联合STF（0.25、0.5 mg/mL）处理，CCK-8检测存活率；Western Blot检测磷酸化AKT（pAKT）、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）及内参GAPDH，并用AKT抑制剂（AKTIV）与ERK抑制剂（U0126）验证通路参与。HPLC鉴定STF中指标成分。

研究结果

3.1. Effects of STF Treatment on Social Behavior, Motor Function, and Anxiety-Like Behavior in Offspring with Perinatal Injury（STF对围产期损伤子代社交行为、运动功能及焦虑样行为的影响）

经HPLC确认STF含橙皮苷（Hesperidin）、6?姜酚（6?Gingerol）及甘草酸（Glycyrrhizic Acid）。行为学检测发现，围产期损伤子代经STF处理后三箱测试中停留于社交区时间显著增加，社交互作缺陷被改善；理毛时间各组无差异，STF未改变重复行为；转棒测试滞留时间各组无差异，运动协调缺陷未被逆转；开场测试总移动距离及中心区穿行次数各组无差异，焦虑样行为未受影响。结论：STF选择性改善该模型中的社交行为缺陷，不影响重复行为、运动协调或焦虑样表型。

3.2. Effects of STF treatment on myelination in the prefrontal cortex of offspring with perinatal injury（STF对围产期损伤子代前额叶皮层髓鞘形成的影响）

DPPH化学清除实验显示STF具剂量依赖性自由基清除能力。免疫组化结果显示围产期损伤致前额叶皮层MBP⁺面积减少，STF处理显著回升MBP⁺阳性区域；同时STF显著恢复Olig2⁺成熟少突胶质细胞及NG2⁺少突胶质前体细胞数量。结论：STF减轻围产期损伤诱导的前额叶皮层髓鞘形成不足，并促进少突胶质细胞谱系恢复。

Involvement of AKT and ERK Signaling in STF-Mediated Protection Against H₂O₂-Induced Cell Death（AKT与ERK信号参与STF介导的H₂O₂诱导细胞死亡保护作用）

体外H₂O₂损伤HOG细胞模型中，STF剂量依赖性地提高分化HOG细胞存活率；Western Blot显示STF维持pAKT水平达24小时，加用AKT抑制剂AKTIV削弱STF的保护作用。H₂O₂上调pERK，STF明显抑制ERK磷酸化；加用ERK抑制剂U0126反而降低STF处理下细胞存活率，提示STF通过抑制过度活化的ERK及维持AKT活化发挥少突胶质细胞抗氧化保护作用。结论：STF通过激活生存信号AKT并抑制促凋亡ERK磷酸化，保护少突胶质谱系细胞免受氧化应激诱导死亡。

Effects of Oral STF Treatment on Gut Microbiome in Offspring with Perinatal Injury（口服STF对围产期损伤子代肠道菌群的影响）

16S rRNA测序显示围产期损伤子代α多样性与对照组无显著差异，但β多样性组间分离；STF处理使菌群组成向正常偏移（p=0.069）。LEfSe分析示对照组富集Oscillospiraceae科、Erysipelatoclostridiaceae科及Colidextribacter属等，围产期损伤子代这些菌丰度降低，STF可使之回升。相关性分析发现粪便Oscillospiraceae与社交互动时间呈正相关、与理毛时间呈负相关；Colidextribacter丰度与社交互动时间呈正相关。结论：STF改善围产期损伤相关菌群失调，富集Oscillospiraceae和Colidextribacter且与社交行为改善相关，可作潜在治疗响应微生物标志物。

讨论与结论总结

研究人员指出，前期KI essence未能改善行为，而本次针对心脾两虚证优化的STF组成（含Hesperidin、6?Gingerol、Glycyrrhizic Acid）在二次打击围产期损伤模型中不仅恢复前额叶少突胶质细胞谱系及MBP表达、改善髓鞘形成不足，还改善社交行为缺陷并调节菌群失调。少突胶质前体对围发育窗氧化/炎症敏感，STF促进其恢复可能助益髓鞘修复。Oscillospiraceae在ASD儿童中常减少，Colidextribacter与抗抑郁样行为相关，本研究两者均与社交改善正相关，提示靶向富集有益菌为ASD相关症状微生态干预方向。前额叶社交回路较运动/焦虑回路在后期恢复阶段具更高可塑性，或可解释STF选择性改善社交行为。局限含未进行粪菌移植验证因果、未做性别分层分析。

结论翻译：本研究表明，口服健脾方（STF）治疗可改善围产期损伤子代的社交行为缺陷、减轻髓鞘形成不足并部分恢复肠道微生物平衡。上述观察结果间直接的因果关系仍有待确立，未来需探明STF是否通过菌?肠?脑轴相关通路发挥作用。