DGAT1驱动非洲裔美国前列腺癌患者癌相关成纤维细胞活化及脂质重构促进肿瘤进展的分子机制

《Cancer Research Communications》：DGAT1 increases LD density in BHPrS1 cells. A, BHPrS1DGAT1 and... Open Access

　　

致死性前列腺癌 disproportionately 影响非洲裔美国（AA）男性，与欧洲裔美国（EA）男性相比，其发病率更高且发病年龄更早，反映出持续存在的生物学与临床差异。近期研究表明，与种族相关的脂质代谢重编程差异是导致该差异的关键因素。研究人员近期鉴定出癌相关成纤维细胞（CAF）作为介导肿瘤进展种族差异的主要基质成分。在此，研究人员证明来自AA患者的富脂质CAF（AACAF）相较于来自EA患者的CAF（EACAF）表现出增强的促肿瘤特性。脂质滴（LD）生物发生与储存分析显示，AACAF中存在稳健的由二酰基甘油O-酰基转移酶1（DGAT1）酶依赖性的LD积累。在良性成纤维细胞中外源性表达DGAT1可诱导CAF标志物[成纤维细胞激活蛋白1（FAP1)和α平滑肌肌动蛋白（αSMA）]的表达，后者与成纤维细胞活化相关，改变分泌组，并显著增强体内前列腺癌细胞的生长。整合转录组学和分泌组学分析鉴定出DGAT1调控的新型基因，这些基因涉及与代谢、细胞-细胞通讯、运动能力和血管生成相关的CAF功能，主要通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号激活介导。药理学DGAT1抑制可抑制这些通路，并引发肿瘤促进介质[包括脑源性神经营养因子（BDNF）、血管内皮生长因子（VEGF）和血栓反应蛋白1（TSP1）]的种族差异性调控。机制实验表明，从功能角度看，与EACAF相比，来自AA患者的富脂质CAF表现出增加的成纤维细胞活化和具有更强促肿瘤活性的分泌表型。综上，这些发现揭示DGAT1是AA男性前列腺癌肿瘤微环境中成纤维细胞活化和脂质驱动重构的关键酶学调节因子。靶向DGAT1是破坏代谢-基质串扰、减轻前列腺癌进展中种族相关差异的有前景的策略。研究意义：该研究强调，AA前列腺癌患者CAF中DGAT1驱动的脂质积累是促进成纤维细胞活化及其促肿瘤作用从而导致种族差异的关键驱动因素。靶向DGAT1可破坏脂质介导的癌-基质相互作用，为减少AA男性侵袭性前列腺癌提供了一种新的治疗策略。

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，但其发病率和死亡率的种族差异长期存在，尤其是非洲裔美国（AA）男性相较于欧洲裔美国（EA）男性面临更高的发病风险和更早的发病年龄。尽管社会经济因素、医疗可及性和筛查实践对这种差异有重要贡献，但流行病学和分子研究表明这些因素不足以完全解释差异的幅度，提示潜在的生物学机制也在前列腺癌风险和进展中发挥重要作用。与祖先相关的遗传和表观遗传改变、肿瘤代谢以及肿瘤微环境（TME）被公认为是种族差异的关键贡献因素，但在前列腺癌中的具体分子机制仍不明确。癌相关成纤维细胞（CAF）作为TME中的重要基质成分，能够主动调控旁分泌信号网络直接影响上皮肿瘤细胞行为。此前研究已发现AACAF具有增强的分泌表型，可促进致瘤性、新生血管形成和炎症细胞招募，且鉴定出脑源性神经营养因子（BDNF）可能作为CAF-癌细胞串话的介质，但上游代谢驱动因素和下游信号介质仍不清楚。脂质代谢重编程是肿瘤和基质细胞中的核心适应性机制，AA男性前列腺组织总脂肪酸和游离脂肪酸水平升高与更具侵袭性的疾病和更差的预后相关，提示脂质可利用性可能在特定人群中选择性放大基质代谢适应。据此，研究人员开展了本项研究，旨在阐明基质DGAT1在AACAF中的分子机制及其对TME重塑和肿瘤细胞致瘤性的影响，研究成果发表于《Cancer Research Communications》。

本研究主要运用了以下关键技术方法：从AA和EA前列腺癌患者（经机器人辅助腹腔镜前列腺切除术获得，样本队列经NSUHS机构审查委员会批准）分离原代CAF并进行传代培养验证；构建DGAT1过表达及空载体质粒并进行慢病毒转导建立稳定细胞系；采用Oil Red O和杨红（Nile Red）染色结合流式细胞术进行LD定量分析；建立皮下肾囊异种移植瘤模型（SCID小鼠）评估体内致瘤性；实施RNA测序（RNA-seq）及生物信息学分析（STAR比对、DESeq2差异分析、edgeR校正和基因本体论GO富集分析）；应用人类细胞因子抗体芯片检测分泌因子谱；通过蛋白质免疫印迹检测通路蛋白及CAF标志物；并结合药理学抑制实验（DGAT1抑制剂A-922500和ERK1/2抑制剂U0126）进行功能验证。

**种族差异的基质DGAT1表达显示AACAF相较于EACAF具有增强的脂质储存反应**

研究人员首先通过Oil Red O染色评估原代CAF的LD状态，发现AACAF基础LD密度高于EACAF，且100 μmol/L油酸（OA）处理可显著增加AACAF中LD积累。定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹显示，AACAF中DGAT1 mRNA和蛋白水平均显著高于EACAF（>2倍，P < 0.05），而DGAT2虽表达更高但无显著种族差异。在OA诱导的脂肪酸过载条件下，两组DGAT1蛋白表达均增加，但AACAF反应更强。脂质代谢基因分析显示AACAF中脂肪分解因子PEDF内源性表达降低，导致更高的DGAT1/PEDF比值，促使平衡向LD积累偏移。免疫组织化学分析在小队列前列腺癌组织中发现，AA患者样本中DGAT1⁺基质细胞数量多于EA患者。临床病理特征分析显示两组体重指数无差异，但AA患者接受机器人辅助腹腔镜前列腺切除术时年龄显著更轻，与前列腺癌在AA男性中更早发生的报道一致。

**前列腺成纤维细胞中DGAT1过表达诱导CAF活化**

为探究DGAT1在CAF生物学中的作用，研究人员将DGAT1-GFP融合慢病毒载体转导至良性人前列腺成纤维细胞BHPrS1，建立BHPrS1^DGAT1及对照BHPrS1^EV细胞系。流式细胞术显示血清饥饿同步化的BHPrS1^DGAT1细胞计数显著增加（P < 0.首关）。蛋白质免疫印迹证实BHPrS1^DGAT1中DGAT1表达升高约50倍，且多种CAF标志物显著上调：成纤维细胞激活蛋白（FAP）升高150倍、α平滑肌肌动蛋白（αSMA）升高50倍、波形蛋白（vimentin）升高50倍（P < 0.01），而腱生蛋白C（TN-C）、血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）和成纤维细胞刺激蛋白-1（FSP-1）变化较小。LD调控因子分析显示，DGAT1过表达未影响DGAT2表达，但显著降低脂肪分解ATGL激活因子PEDF的表达（P < 0.05），而未影响ATGL水平，提示DGAT1可通过促进脂肪生成同时抑制脂肪分解来改变净脂质通量。

**BHPrS1^DGAT1中LD储存在DGAT1酶抑制剂作用下减少**

基于DGAT1过表达升高脂肪生成/脂肪分解比值，研究人员采用流式细胞术检测中性脂质积累。基于BHPrS1^EV基线建立高LD密度（LDD）和低LDD两个门控，结果显示OA处理48小时后两组高LDD细胞比例均显著增加（P < 0.05），而选择性DGAT1酶活性抑制剂（DGAT1i）可降低高LDD及OA诱导效应。Nile Red染色和共聚焦显微镜观察显示，BHPrS1^EV经OA处理后较小LD积累增加；BHPrS1^DGAT1细胞的LD变化模拟了OA对BHPrS1^EV的诱导效应，且基础条件下即形成更大LD。BHPrS1^DGAT1对OA暴露仍有反应，LD计数进一步增加。DGAT1酶活性阻断可将BHPrS1^DGAT1的LD大小恢复至BHPrS1^EV基线水平。核LD积累显示与胞质LD相似的尺寸分布模式。

**BHPrS1^DGAT1细胞诱导前列腺癌肿瘤生长和体内侵袭**

DGAT1过表达诱导了CAF活化和脂质储存，研究人员进而评估其促进肿瘤进展的功能。条件培养基（CM）实验显示，BHPrS1^DGAT1 CM相较于BHPrS1^EV CM可显著增强BPH1细胞Ki67阳性比例（P < 0.05），且对LNCaP和PC-3细胞具有类似促增殖效应；DGAT1i处理可减弱此效应。体内肾囊异种移植实验表明，BHPrS1^DGAT1与BPH1或LNCaP重组可显著增强致瘤性，增加肿瘤生长和侵袭（P < 0.05）；PC-3肿瘤大小虽不受影响，但侵袭能力增强。组织学显示BPH1细胞转化为腺癌伴多灶性鳞状分化，LNCaP和PC-3细胞出血区域增加。与BHPrS1^EV对照相比，LNCaP和PC-3联合BHPrS1^DGAT1显示向肾实质侵袭增加。免疫组织化学证实GFP阳性BHPrS1细胞在肿瘤基质中持续存在数周。Ki67染色显示BPH1和LNCaP细胞增殖增强，微血管密度（MVD）和CD31染色指数在LNCaP肿瘤中升高（P < 0.05）。

**BHPrS1^DGAT1细胞通过ERK通路活化分泌促肿瘤因子**

RNA-seq分析显示BHPrS1^DGAT1相较于BHPrS1^EV上调897个基因、下调697个基因。基因本体论分析揭示细胞因子调控、轴突导向以及Ras、Rap和cAMP信号通路等相关基因改变。定量RT-PCR验证BHPrS1^DGAT1中BDNF转录表达增加，且原代良性前列腺成纤维细胞DGAT1瞬时转染后BDNF表达亦增加。细胞因子芯片检测分泌因子谱显示显著差异：RANTES、IP10、IL18Bpa和GM-CSF下调，而VEGF、MCP1、FGF19、内皮糖蛋白（endoglin）、CD14和BDNF上调。蛋白质免疫印迹检测到磷酸化ERK（pERK）显著增加，而磷酸化Akt（pAkt）无变化，提示DGAT1通过ERK而非Akt通路介导效应。

**DGAT1抑制对AACAF与EACAF分泌因子的差异性调控及其对CAF旁分泌刺激效应的减弱作用**

ERK抑制剂U0126（10 μmol/L）处理72小时可显著降低两组BDNF分泌（P < 0.05），同时VEGF降低而TSP1在BHPrS1^DGAT1中相较于BHPrS1^EV显著增加。原代CAF中AACAF较EACAF显示略高的pERK1/2，DGAT1i降低两组pERK水平，且在AACAF中效应更强。DGAT1抑制对分泌因子的调控呈现种族差异：未处理AACAF中BDNF和VEGF较高、TSP1较低；DGAT1i处理后，AACAF中BDNF和VEGF下调而TSP1上调，EACAF则呈现相反趋势。活细胞成像显示AACAF CM可促进LNCaP和PC-3增殖，而DGAT1i预处理可减弱此效应。

**讨论部分总结**

研究人员指出，AA男性肥胖和高脂血症患病率高于EA男性，腹部肥胖常与侵袭性前列腺癌相关。过量脂质积累导致非脂肪细胞异位储存，为癌细胞提供能量储备。本研究中，DGAT1作为LD中甘油三酯储存的关键酶，在AACAF中mRNA和蛋白水平均显示种族差异。AACAF基础DGAT1水平升高，脂质过载时LD上调与DGAT1表达种族差异相关。通过增加良性前列腺成纤维细胞BHPrS1中DGAT1水平，可刺激基质LD生物发生和储存；BHPrS1^DGAT1中PEDF显著降低，种族差异的PEDF水平可能改变ATGL脂肪分解功能，促进DGAT1诱导的脂肪生成。脂质富集成纤维细胞（lipofibroblasts）近期在肺癌TME中被鉴定，但DGAT1是否诱导前列腺成纤维细胞亚群重编程类似lipofibroblasts尚不清楚。

DGAT1除作为能量来源和LD储存外，还支持CAF活化，BHPrS1^DGAT1显示独特转录组和分泌组。FAP作为关键CAF标志物增加，该分子在促进侵袭和转移中具有多重作用；TNC表达亦呈增加趋势，其在AACAF中水平更高且与MVD增加和肿瘤相关巨噬细胞浸润相关。这表明DGAT1诱导的脂质重编程与新型CAF活化通路相连。

CAF与癌细胞的旁分泌相互作用在肿瘤进展中至关重要。DGAT1介导的LD生物发代代表协调促肿瘤分泌因子产生的核心代谢检查点，显著增强前列腺癌细胞的体外增殖。通过酯化过量游离脂肪酸为中性脂质，DGAT1限制脂毒性应激，同时促进富含细胞因子、趋化因子和生长因子的转录和分泌程序，包括BDNF、VEGF、IL11、CCL2（MCP-1）、CCL5（RANTES）、CXCL1（GROα）和白血病抑制因子（LIF）等，这些因子汇聚于STAT3、MAPK/ERK和PI3K/AKT等互补信号通路增强癌细胞增殖、存活、上皮-间充质转化、血管生成、免疫逃逸和治疗抵抗。此外，BHPrS1^DGAT1在体内促进增加侵袭、血管生成和炎症浸润招募，有利于前列腺癌细胞系致瘤性。

研究人员鉴定出ERK1/2信号通路对VEGF、TSP-1和BDNF的新型差异性种族调控。DGAT1抑制在AACAF中减少BDNF分泌的同时显著增加其在EACAF中的表达，这种潜在的种族相关有害效应提示在个性化治疗中必须识别和考虑未知的潜在差异。虽然社会经济、环境和文化因素起主要作用，但遗传性遗传变异也可能在药物反应和不良药物反应中发挥作用。基于种族的药物基因组学目前仍具挑战性，更好地理解生物学反应被视为创建更有效更安全个性化药物的关键。

研究结论：总体而言，该研究证明了前列腺癌患者基质DGAT1表达存在种族差异。从前列腺癌患者分离的CAF及工程细胞系BHPrS1^DGAT1表明DGAT1参与CAF表型活化，体内数据证实增加的基质DGAT1促进肿瘤生长和侵袭。研究人员鉴定出BHPrS1^DGAT1细胞中以ERK1/2依赖性方式调控的DGAT1靶分泌因子，这些因子促进肿瘤进展。AACAF与EACAF对DGAT1抑制的差异反应有待进一步研究CAF生物学，并强调基于种族分层个性化方法的必要性。