CD4+T细胞使缺乏CD73的拟间质(quasi-mesenchymal, qM)乳腺肿瘤对抗CTLA4免疫检查点阻断疗法致敏

《Cancer Research Communications》：CD4+ T Cells Sensitize Quasimesenchymal Breast Tumors Lacking CD73 to Anti-CTLA4 Immune Checkpoint Blockade Therapy Open Access

　　

尽管免疫检查点阻断(Immune Checkpoint Blockade, ICB)疗法在某些癌症类型中产生了显著疗效，但乳腺肿瘤大多对此无反应。上皮–间质可塑性(Epithelial–Mesenchymal Plasticity, EMP)导致免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)的形成，并使乳腺肿瘤对免疫治疗产生耐药性。重要的是，靶向CD73可完全使拟间质(quasi-mesenchymal, qM)乳腺肿瘤对抗CTLA4 ICB疗法致敏，但其致敏机制尚不清楚。研究人员证实，在qM乳腺肿瘤中靶向CD73使其对抗CTLA4 ICB疗法致敏依赖于CD4+T细胞。此外，EMP导致人三阴性乳腺癌中癌细胞内源性CD73表达升高。鉴于qM癌细胞具有转移及抵抗多种治疗的能力，这些发现可为制定人乳腺癌治疗的转化策略提供指导。这些发现还突出了利用癌细胞表型可塑性及CD73和CD4+T细胞作为免疫治疗反应性预测标准的潜在可能性。 意义：EMP促进转移并驱动对多种治疗方案的耐药。研究人员的工作强调了利用CD4+T细胞、CD73及癌细胞可塑性作为ICB治疗反应性预测标准的可能性。

论文解读：《CD4⁺T细胞使缺乏CD73的拟间质乳腺肿瘤对抗CTLA4免疫检查点阻断疗法致敏》

一、研究背景与概述

免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）已在黑色素瘤和肺癌中取得突破，但大部分乳腺肿瘤尤其是三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）对其原发耐药。上皮–间质可塑性（Epithelial–Mesenchymal Plasticity, EMP）可产生部分或完全间充质状态的癌细胞，其中拟间质（quasi-mesenchymal, qM）状态与免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）组装及ICB耐药密切相关。前期研究发现，靶向qM乳腺肿瘤细胞内在的CD73（胞外-5'-核苷酸酶，由NT5E基因编码，可催化腺苷生成发挥免疫抑制作用）可使肿瘤完全对抗CTLA4（Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4）单抗致敏，但介导此清除效应的免疫细胞亚群不明。本文由Dongre A等人发表于《Cancer Research Communications》，旨在明确CD73缺失的qM乳腺肿瘤经抗CTLA4 ICB被清除所依赖的免疫细胞类型及分子关联。研究人员利用MMTV-PyMT小鼠来源的上皮及Snail^HIqM（sgCD73，CD73敲除）乳腺肿瘤细胞系，结合体内ICB治疗、抗体体内耗竭、基因敲除小鼠模型、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、流式细胞术及公开人乳腺癌数据库分析，证明CD4⁺T细胞是致敏的必要效应细胞，且人乳腺癌中CD73表达与EMP及基底样/ TNBC亚型正相关。

二、主要关键技术方法

研究人员采用MMTV-PyMT自发成瘤模型分离的上皮及Snail^HIqM（sgCD73敲除及CD73/B2M双敲除Double Knockout, DKO）小鼠乳腺肿瘤细胞系，原位接种于C57BL/6J野生型（Wild Type, WT）、CD4-KO、CD8-KO、MHC-II-KO及B2M-KO小鼠。给予抗CTLA4（clone 9H10）、抗CD73（clone TY/23）单抗治疗或联合方案，并行抗CD4、抗CD8a、抗NK1.1、抗CSF1R、抗γδ TCR体内耗竭实验。肿瘤行胶原酶消化制备单细胞悬液进行流式细胞术检测T细胞活化/耗竭/细胞因子标志物；部分肿瘤行scRNA-seq（10x Genomics 3′）及免疫荧光染色观察CD4⁺/CD8⁺T细胞浸润。人乳腺癌细胞系诱导EMP（SLUG+SOX9过表达或TGFβ处理）验证CD73上调；利用Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）、已发表小鼠KPB25Luv及人乳腺癌scRNA-seq数据集分析NT5E与EMP特征、乳腺癌亚型的相关性。

三、研究结果

Presence of T cells in responding tumors（应答肿瘤中T细胞的存在）

对qM对照与sgCD73肿瘤进行scRNA-seq，发现sgCD73肿瘤在未治疗前即富集CD4⁺T细胞且调节性T细胞（Treg）减少；抗CTLA4治疗后sgCD73及抗CD73+抗CTLA4联合治疗的qM肿瘤中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞浸润显著增加，且CD4⁺T细胞数量高于CD8⁺T细胞。

CD8⁺T cells are partially important for regulating responses of qM tumors lacking CD73 to anti-CTLA4 ICB（CD8⁺T细胞对缺乏CD73的qM肿瘤响应抗CTLA4 ICB仅具部分重要性）

抗CD8a抗体耗竭或CD8-KO、B2M-KO小鼠中，sgCD73肿瘤仍对抗CTLA4 ICB敏感且肿瘤内CD4⁺T细胞招募不受影响；Snail^HIqM肿瘤联合治疗（抗CD73+抗CTLA4）在CD8耗竭后亦有效。表明CD8⁺T细胞非必需，sgCD73肿瘤致敏仅部分依赖CD8⁺T细胞。

CD4⁺T cells drive sensitivity of qM tumors lacking CD73 to anti-CTLA4 ICB（CD4⁺T细胞驱动缺乏CD73的qM肿瘤对抗CTLA4 ICB的敏感性）

抗CD4抗体耗竭或CD4-KO、MHC-II-KO小鼠中，sgCD73肿瘤对抗CTLA4 ICB不再敏感（与WT对照组比）；Snail^HIqM肿瘤联合治疗在CD4耗竭或CD4-KO小鼠中也失效。流式显示sgCD73肿瘤经抗CTLA4处理后早期（2周）肿瘤内CD4⁺T细胞中IFNγ及T-BET（TBET）表达显著升高，提示Th1样极化，其他CD4⁺T细胞亚群比例无变化。

Abrogation of MHC-I from qM tumors lacking CD73 drives sensitivity to anti-CTLA4 ICB in a CD4⁺T cell–dependent manner（去除缺乏CD73的qM肿瘤中MHC-I同样以CD4⁺T细胞依赖方式驱动对抗CTLA4 ICB敏感性）

构建CD73/B2M双敲除（DKO）细胞（MHC-I表面缺失，排除CD8⁺T细胞识别），DKO肿瘤仍对抗CTLA4 ICB敏感；耗竭CD8⁺T细胞、NK细胞（抗NK1.1）、巨噬细胞（抗CSF1R）或γδ T细胞均不逆转敏感性，但耗竭CD4⁺T细胞或植入CD4-KO小鼠则失去响应。治愈小鼠再攻击（rechallenge）可长期无瘤生存，此记忆保护依赖CD4⁺T细胞（耗竭CD4后丧失）。

EMP is associated with CD73 expression in other murine models and human breast cancers（EMP与其他小鼠模型及人乳腺癌中CD73表达相关联）

分析KPB25Luv（Brca1^?/?Trp53^?/?TNBC） scRNA-seq，Nt5e（Cd73）特异性高表达于具部分EMP（partial EMT, pEMT）特征的肿瘤细胞亚群及Foxp3⁺Treg。CCLE及人乳腺癌细胞系/患者scRNA-seq显示NT5E在基底样/TNBC中最高，与pEMT及EMT转录因子（SNAI2/SLUG、ZEB2、SMAD3、FOXC2）正相关，与管腔因子（FOXA1、PBX2）负相关。MCF7RAS经SLUG+SOX9或TGFβ诱导EMP后CD73上调，撤除TGFβ后二者同步下降，证实EMP可逆调控CD73。

四、讨论与结论翻译

上皮–间质可塑性（EMP）促进转移并驱动乳腺癌对包括ICB在内的多种疗法耐药。前期工作表明癌细胞内源性CD73介导qM乳腺肿瘤对抗CTLA4 ICB耐药，靶向CD73可完全致敏。本研究进一步明确：qM乳腺肿瘤缺失CD73后对抗CTLA4 ICB的清除效应完全依赖CD4⁺T细胞而非CD8⁺T细胞；sgCD73甚至CD73/B2M双敲除肿瘤中MHC-I缺失仍由CD4⁺T细胞介导致敏，且CD4⁺T细胞参与长期免疫记忆形成。响应肿瘤早期富集Th1样（IFNγ⁺T-BET⁺） CD4⁺T细胞。人乳腺癌及细胞系中CD73表达与EMP程序及基底样/TNBC亚型强相关，EMT转录因子可因果性上调CD73。综上，CD4⁺T细胞使缺乏CD73的拟间质乳腺肿瘤对抗CTLA4 ICB致敏；癌细胞EMP状态、CD73表达及CD4⁺T细胞浸润可作为乳腺癌ICB反应性的预测指标，靶向CD73联合抗CTLA4有望克服难治性qM/TNBC的免疫治疗耐药。