Plutella xylostella 中 Ryanodine 受体 G4946E/V 突变所赋予的不对称二酰胺抗性

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Asymmetric diamide resistance conferred by ryanodine receptor G4946E/V mutations in Plutella xylostella

　　

王兴亮|江东|胡睿|吴书文|史宇|杨一华|吴一东

中国南京农业大学植物保护学院农业与林业生物安全国家重点实验室，南京211800

摘要

小菜蛾（Plutella xylostella）已经对二酰胺类杀虫剂产生了抗性，这威胁到了全球十字花科作物的生产。尽管在多种鳞翅目害虫中已经记录了特定瑞诺丁受体（RyR）突变的趋同进化，但在统一的遗传背景下对这些关键农业物种的功能验证仍然缺乏。我们利用CRISPR/Cas9技术在易感的小菜蛾背景下生成了G4946E和G4946V纯合子敲入株。生物测定显示，这两种突变对二酰胺类杀虫剂表现出不对称的抗性：对邻苯二甲酸二酰胺类杀虫剂氟苯二甲酰胺具有极高的抗性（G4946E和G4946V均为1613倍），而对苯胺酸二酰胺类杀虫剂氯虫腈的抗性仅为中等（G4946E为76倍，G4946V为87倍）。遗传分析证实这种抗性是常染色体上的且为不完全隐性。通过将这些结果与我们之前的研究进行比较，我们为田间抗性等位基因的时空变化提供了机制解释：在氟苯二甲酰胺最初使用期间，G4946E提供了选择优势，但其对氯虫腈的中等抗性可能导致其被I4790K取代，后者对这两种二酰胺类杀虫剂都具有高水平的抗性。我们的发现提供了体内证据，证明单个G4946替换足以产生显著的抗性，并为RyR突变在应对不断变化的杀虫剂选择压力下的适应景观和进化轨迹提供了见解。

引言

二酰胺类杀虫剂是杀虫剂发展中的一个重要里程碑，被杀虫剂抗性行动委员会（IRAC，2025）归类为第28组。氟苯二甲酰胺作为这一组的先驱化学物质（Tohnishi等人，2010年），随后是苯胺酸二酰胺类杀虫剂氯虫腈（Bentley等人，2010年）。二酰胺类杀虫剂通过特异性靶向和调节昆虫的瑞诺丁受体（RyR）通道来触发细胞内钙离子的无控制释放，从而导致肌肉麻痹和最终死亡（Ebbinghaus-Kintscher等人，2006年）。由于它们对鳞翅目害虫具有极高的选择性、良好的环境特性以及对非目标生物体的最小风险（Du和Fu，2023年），氟苯二甲酰胺和氯虫腈已在全球农业系统中得到广泛应用。

然而，密集和重复的应用对目标害虫的田间种群施加了强烈的选择压力，推动了抗性的快速进化。根据节肢动物杀虫剂抗性数据库（APRD，2026年）的数据，至少有二十二种害虫已经对二酰胺类杀虫剂产生了抗性。一个特别令人担忧的例子是小菜蛾（Plutella xylostella），这种害虫对十字花科作物具有全球性的破坏性，每年造成的经济损失估计为40-50亿美元（Furlong等人，2013年；Zalucki等人，2012年）。自从首次在中国报道小菜蛾对二酰胺类杀虫剂产生抗性（Wang和Wu，2012年）以来，亚洲、美洲和澳大利亚各地相继发现了许多抗性种群（Steinbach等人，2015年；Ward等人，2021年），这突显了可持续管理这一关键经济害虫所面临的日益严峻的挑战。

鳞翅目害虫中二酰胺类抗性的进化主要由RyR基因的目标位点突变驱动，这些突变会损害杀虫剂的结合亲和力（Samurkas等人，2022年）。迄今为止，在包括小菜蛾（P. xylostella）、Tuta absoluta、Spodoptera exigua、S. litura、S. frugiperda和Chilo suppressalis在内的多种具有经济意义的物种中，已经鉴定出了G4946和I4790等关键突变（Kim等人，2025年）。这些点突变的趋同进化表明它们在赋予抗性方面具有功能上的保守性。值得注意的是，虽然G4946E、I4790M和I4790K最初是在小菜蛾（P. xylostella中报道的（Guo等人，2014年；Jouraku等人，2020年；Troczka等人，2012年），但G4946V变体最初是在欧洲的T. absoluta种群中发现的，后来在中国的小菜蛾种群中也检测到了（Roditakis等人，2017年；Qin等人，2018年）。因此，小菜蛾是阐明二酰胺类抗性分子机制的理想模型生物。

RyR突变的功能验证传统上依赖于放射性配体结合、钙成像或基因编辑的Drosophila melanogaster（Douris等人，2017年；Huang等人，2020年；Troczka等人，2015年）。尽管这些方法提供了宝贵的见解，但由于细胞环境或受体异构体的潜在差异，它们可能无法完全再现目标害虫的杀虫剂反应。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术的出现彻底改变了这一范式，使得在农业相关昆虫中能够精确地建立基因型-表型关联。

几项开创性的敲入研究已经证实了I4790M/K在小菜蛾（P. xylostellaS. exigua中的作用（Jiang等人，2024年；Wang等人，2020年；Zuo等人，2017年）。然而，仍存在一些关键空白。具体来说，G4946V突变尚未在任何主要农业害虫中得到敲入，而且目前还缺乏在统一遗传背景下对这些关键突变的系统比较。此外，这些特定突变是否导致了邻苯二甲酸二酰胺类和苯胺酸二酰胺类杀虫剂效力之间的显著表型差异仍很大程度上未被探索。迫切需要澄清这些差异抗性谱型，以预测交叉抗性风险并指导田间二酰胺类杀虫剂的合理轮换。

在我们之前的工作中，我们基于小菜蛾的易感IPP-S背景生成了I4790M和I4790K敲入株（Jiang等人，2024年；Wang等人，2020年）。本研究利用CRISPR/Cas9将G4946E和G4946V突变引入PxRyR位点，使我们能够首次在相同的遗传背景下直接比较这些关键突变的影响。我们的发现不仅证实了G4946E和G4946V的单独作用，还定义了多个关键目标位点突变的相对抗性强度，为下一代杀虫剂设计和基于证据的抗性管理提供了重要见解。

章节片段

昆虫与饲养

易感杀虫剂的P. xylostella品系（IPP-S）来自中国农业科学院植物保护研究所（北京，中国）。该品系最初于2010年在中国湖北省武汉采集，自那时起一直在实验室中饲养，未接触过任何杀虫剂。以IPP-S为亲本品系，通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术生成了G4946E-KI和G4946V-KI突变株。这些品系是纯合的

为了建立G4946E敲入株，将sgRNA、G4946E-ssODN和Cas9蛋白混合物微注射到800个新鲜产下的IPP-S品系卵中。其中80个卵孵化出幼虫，其中80个成功发育为成虫（G0代）。使用G0代的雄性和雌性进行了33次单对杂交，产生了G1代。从每个G1代的10个三龄幼虫中提取基因组DNA，然后进行PCR扩增。

讨论

我们的研究提供了体内证据，证明RyR中的单个氨基酸替换G4946E和G4946V足以使小菜蛾这种全球重要的作物害虫产生高水平的二酰胺类抗性。通过在统一的遗传背景下使用CRISPR/Cas9介导的突变敲入，我们系统地分析了与这些突变相关的抗性谱型和遗传模式。这种直接的比较方法不仅建立了

王兴亮：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据管理，概念化。江东：研究，数据管理。胡睿：验证，数据管理。吴书文：项目管理，资金获取。史宇：数据管理。杨一华：监督，项目管理。吴一东：撰写 – 审稿与编辑，监督，数据管理，概念化。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFD1401200）和农业与林业生物安全国家重点实验室联合研究计划（SKLJRP2507）的资助。