《Pharmacological Research》：Microglial OTUD6A promotes neuroinflammation and Alzheimer’s disease pathogenesis by deubiquitinating C/EBPβ
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阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积、神经炎症和认知能力下降为特征的进行性神经退行性疾病。作为大脑主要的免疫细胞，小胶质细胞通过驱动神经炎症反应在AD发病机制中发挥核心作用。去泛素化
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积、神经炎症和认知能力下降为特征的进行性神经退行性疾病。作为大脑主要的免疫细胞，小胶质细胞通过驱动神经炎症反应在AD发病机制中发挥核心作用。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）可调控小胶质细胞的活化，但含有卵巢肿瘤结构域的DUB——OTUD6A在AD中的作用尚不清楚。本研究中，研究人员证实OTUD6A在多种AD模型（包括Aβ灌注小鼠、3×Tg小鼠和APP/PS1小鼠）的小胶质细胞中表达上调。Otud6a基因敲除（knockout，KO）或小胶质细胞特异性敲低Otud6a可改善AD小鼠的认知缺陷并减轻神经炎症。此外，OTUD6A通过去除第253位赖氨酸（lysine 253，K253）处的K48连接泛素链与C/EBPβ结合，从而导致C/EBPβ积累，增强核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路并增加促炎细胞因子产生。而且，OTUD6A催化残基（C157A）突变会消除其去泛素化活性，证实了其在C/EBPβ稳定中的作用。此外，敲低C/EBPβ可逆转OTUD6A介导的神经炎症，验证了小胶质细胞OTUD6A–C/EBPβ–NF-κB轴是AD发病机制中的关键通路。因此，本研究结果强调OTUD6A是小胶质细胞活化的新型调节因子，提示靶向该DUB可能为缓解AD神经炎症提供治疗策略。
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种中枢神经系统的进行性神经退行性疾病，其核心病理特征包括β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积、神经纤维缠结和神经炎症。尽管目前在阐明AD病理生理学方面已取得实质性进展，但其核心致病机制仍未完全明确，现有治疗手段仅能缓解症状，无法阻止或逆转潜在的神经病理损伤。因此，深入探究AD发病机制并寻找新的治疗靶点迫在眉睫。
小胶质细胞作为中枢神经系统的主要免疫细胞，在AD的发生和发展中扮演关键角色。近年来，全基因组关联研究已鉴定出许多在小胶质细胞中高表达的AD风险基因，由小胶质细胞基因驱动的炎症是导致认知障碍的主要原因，可能构成AD的基本致病机制。此外，持续的小胶质细胞活化或急性炎症会导致神经毒性，促进Aβ沉积、tau蛋白磷酸化以及血脑屏障破坏，最终导致神经元损伤和死亡。因此，调控小胶质细胞炎症的蛋白在AD发病机制和潜在治疗靶点挖掘中具有重要作用。
泛素化和去泛素化是关键翻译后修饰，在多种生物学过程中发挥重要作用。去泛素化由去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）介导，其通过从底物蛋白上移除泛素部分以维持蛋白稳定性。越来越多的证据表明，多种DUBs通过调控小胶质细胞炎症参与AD发病机制，例如USP25、USP11、USP19和YOD1等均被报道在AD相关炎症中发挥调控作用。这提示小胶质细胞DUBs是AD治疗的潜在靶点。
卵巢肿瘤去泛素化酶6A（ovarian tumor deubiquitinase 6A，OTUD6A）是DUB家族的重要成员，已被报道可调控多种细胞信号级联反应。近期研究表明，OTUD6A在结肠炎、心脏炎症、肾脏炎症纤维化及先天免疫炎症反应等多种疾病中发挥促炎作用。然而，OTUD6A在AD相关炎症中的作用尚不清楚。基于此，本研究旨在探讨OTUD6A在AD中的作用及其潜在机制。
本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，构建了三种AD动物模型，包括Aβ灌注模型、3×Tg小鼠模型和APP/PS1小鼠模型；其次，通过基因工程技术获得Otud6a基因敲除（knockout，KO）小鼠，并利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的小胶质细胞特异性启动子Cx3cr1递送Otud6a-shRNA，实现小胶质细胞中Otud6a的特异性敲低；第三，综合运用行为学测试（包括Morris水迷宫实验和新物体识别实验）评估小鼠认知功能；第四，采用免疫荧光、蛋白质印迹和实时定量PCR等技术检测小胶质细胞活化标志物及炎症因子表达水平；第五，通过免疫共沉淀结合液相色谱-串联质谱技术筛选并验证OTUD6A的相互作用蛋白；第六，利用环己酰亚胺追踪实验、蛋白酶体抑制剂（MG132）和溶酶体抑制剂（氯喹，chloroquine，CQ）处理，分析C/EBPβ的蛋白稳定性及降解途径；最后，通过点突变技术构建OTUD6A催化失活突变体（C157A）和C/EBPβ泛素化位点突变体（K253R），明确其分子机制。
研究结果显示：
2.1. The expression of OTUD6A is up-regulated in AD model mice and is distributed in microglia
OTUD6A在AD模型小鼠中表达上调且定位于小胶质细胞。研究人员的分析表明，在3×Tg AD模型小鼠、Aβ灌注模型小鼠和APP/PS1 AD模型小鼠的脑组织中，OTUD6A蛋白水平均显著升高。双重标记实验显示，OTUD6A在小胶质细胞中的相对表达水平高于星形胶质细胞，表明在AD条件下，小胶质细胞是表达OTUD6A的主要神经胶质细胞类型。进一步分离原代小胶质细胞、原代星形胶质细胞和原代神经元进行验证，证实OTUD6A主要在小胶质细胞中表达。此外，经不同浓度Aβ处理的原代小胶质细胞和BV2细胞，其OTUD6A表达水平随Aβ浓度升高和时间延长呈剂量依赖性和时间依赖性增加。这些数据表明，小胶质细胞OTUD6A在AD中表达增加，可能介导小胶质细胞炎症和AD进展。
2.2. Otud6a knockout significantly improves cognitive function in AD mice
Otud6a敲除显著改善AD小鼠的认知功能。为评估OTUD6A在AD中的功能，研究人员在Otud6a KO小鼠和野生型对照小鼠中建立了Aβ灌注AD模型，并通过Morris水迷宫和新物体识别测试评估认知表现。在Morris水迷宫定向导航测试中，Aβ灌注AD模型小鼠的平均逃避潜伏期较野生型组显著增加，而Otud6a KO-Aβ组小鼠的逃避潜伏期较野生型-Aβ组显著缩短。移除平台后的空间探索测试中，Otud6a KO-Aβ小鼠穿越原平台位置的次数更多，且在目标象限停留的时间显著长于野生型-Aβ小鼠，表明其空间记忆保持能力增强。随后采用新物体识别测试评估各组小鼠的探索行为，结果显示Otud6a KO-Aβ组小鼠对熟悉物体和新物体的探索次数及对新物体的探索时间均显著多于野生型-Aβ组。这些发现表明，Otud6a敲除显著改善了Aβ灌注AD小鼠模型的学习和认知功能。
2.3. Otud6a knockout inhibits microglial inflammation in AD mice
Otud6a敲除抑制AD小鼠的小胶质细胞炎症。研究人员评估了Otud6a敲除对小胶质细胞炎症的影响。免疫荧光染色Iba1标记的小胶质细胞显示，Otud6a KO-Aβ组小胶质细胞活性降低。蛋白质印迹分析Iba1进一步证实，Otud6a敲除小鼠的小胶质细胞活化程度降低。此外，Otud6a KO-Aβ组炎症因子表达显著低于野生型-Aβ组，表明Otud6a敲除减轻了Aβ诱导的神经炎症。小胶质细胞活化和炎症因子释放可能导致神经元死亡，研究人员还评估了神经元存活情况。Otud6a KO-Aβ小鼠中NeuN阳性神经元数量高于野生型-Aβ小鼠。此外，免疫荧光染色显示，野生型-Aβ组中神经元标志物MAP2和突触标志物PSD95均显著降低，而Otud6a KO-Aβ组中这些信号得以保留。综上所述，这些发现提示Otud6a敲除可能通过抑制小胶质细胞相关炎症并减少随后的神经元和突触损伤，从而改善AD小鼠的认知功能。
2.4. Microglial Otud6a deficiency ameliorates neuroinflammation and cognitive defects in 3 ×Tg- mice
小胶质细胞Otud6a缺乏改善3×Tg小鼠的神经炎症和认知缺陷。由于前期数据表明OTUD6A主要在小胶质细胞中表达，为深入研究OTUD6A在AD小胶质细胞中的作用，研究人员构建了携带小胶质细胞特异性启动子Cx3cr1的腺相关病毒以递送Otud6a-shRNA，并将其注射到野生型和3×Tg小鼠海马体中以特异性敲低小胶质细胞中的Otud6a，随后评估小胶质细胞特异性敲低Otud6a是否能通过抑制炎症来缓解3×Tg小鼠的认知障碍。在Morris水迷宫定向导航测试中，3×Tg-AAV-shOtud6a组小鼠的逃避潜伏期较3×Tg-AAV-shNC组显著缩短。移除平台后，3×Tg-AAV-shOtud6a小鼠穿越原平台位置的次数更多，且在目标象限停留的时间显著长于3×Tg-AAV-shNC小鼠。随后采用新物体识别测试追踪各组小鼠运动轨迹，3×Tg-AAV-shOtud6a小鼠对旧物体和新物体的探索次数以及对新物体的探索时间均多于3×Tg-AAV-shNC小鼠。这些结果表明，小胶质细胞Otud6a敲低显著改善了3×Tg小鼠的认知障碍。
同样，分析Iba1表达水平显示，Otud6a敲低显著减少了Iba1阳性细胞数量。此外，Iba1的蛋白质印迹分析表明，Otud6a敲低小鼠的小胶质细胞活化程度降低。蛋白质印迹和实时定量PCR进一步验证，Otud6a敲低显著降低了3×Tg小鼠的炎症因子水平。研究人员进一步检查了神经元的凋亡情况，发现小胶质细胞Otud6a敲低逆转了3×Tg小鼠NeuN阳性细胞数量的减少。总之，这些结果暗示小胶质细胞Otud6a缺乏可能增强认知功能并抑制3×Tg小鼠的炎症。
2.5. OTUD6A promotes microglial inflammation in vitro
OTUD6A在体外促进小胶质细胞炎症。为评估OTUD6A是否影响体外小胶质细胞炎症，首先确定小胶质细胞中沉默OTUD6A的最佳条件。用Aβ处理OTUD6A沉默的小胶质细胞以诱导炎症，并收集样本进行炎症因子表达的实时定量PCR分析。结果显示，Aβ显著增加促炎细胞因子水平，而OTUD6A沉默有效降低了这一现象。正如预期，小胶质细胞中OTUD6A过表达促进了炎症因子的表达。过度活化的小胶质细胞会放大炎症以诱导神经元损伤。为进一步表征小胶质细胞活化，研究人员还检查了其他活化相关标志物。OTUD6A沉默降低了Aβ诱导的炎症活化标志物iNOS和Cd86的表达，Cd68也表现出相应变化。接下来评估了与替代活化相关表型的标志物，与Aβ处理组相比，OTUD6A沉默增加了Arg1和Cd206的表达。相反，OTUD6A过表达增强了iNOS、Cd86和Cd68的表达，尤其是在Aβ存在的情况下，同时降低了Arg1和Cd206的表达。这些结果表明，OTUD6A在体外促进促炎小胶质细胞活化状态。由于过度活化的小胶质细胞会放大炎症从而诱导神经元损伤，研究人员随后收集来自不同处理BV2细胞的条件培养基并应用于PC12细胞。来自Aβ处理BV2细胞的条件培养基降低了PC12细胞活力，而来自OTUD6A沉默BV2细胞的条件培养基显著提高了细胞活力。同样，来自OTUD6A沉默BV2细胞的条件培养基减少了PC12细胞的LDH释放。此外，TUNEL染色显示，来自Aβ处理BV2细胞的条件培养基增加了PC12细胞凋亡，而BV2细胞中OTUD6A沉默减弱了这一效应。综上所述，这些发现表明OTUD6A正向调控小胶质细胞相关炎症活化，并在体外间接促进神经元损伤。
2.6. OTUD6A binds to C/EBPβ
OTUD6A与C/EBPβ结合。DUBs通常通过调控其底物蛋白的稳定性或活性来影响下游生物学过程。为鉴定小胶质细胞中OTUD6A的潜在底物，研究人员将NIH/3T3细胞转染空Flag载体或Flag-OTUD6A构建体，随后进行免疫共沉淀和液相色谱-串联质谱分析。在候选OTUD6A相互作用蛋白中，C/EBPβ成为一个值得关注的分子。质谱数据鉴定出的C/EBPβ特异性肽段如图所示。值得注意的是，C/EBPβ与AD中小胶质细胞炎症的调控高度相关，这与OTUD6A在AD发病机制中的假定作用非常吻合。C/EBPβ是C/EBP转录因子家族的成员，也是泛素-蛋白酶体系统的已知底物，其积累已知会加剧小胶质细胞介导的炎症反应。基于这些发现，研究人员假设OTUD6A可能通过靶向C/EBPβ作为关键下游底物来调控小胶质细胞炎症。接下来，研究人员检查了OTUD6A与C/EBPβ之间的直接相互作用。在AD模型脑组织和Aβ诱导的BV2细胞中观察到OTUD6A与C/EBPβ的内源性结合。为进一步证实这种相互作用，研究人员在共转染Flag标记的OTUD6A和His标记的C/EBPβ的NIH/3T3细胞中进行Co-IP。这些结果表明，外源Flag-OTUD6A能有效共沉淀His-C/EBPβ，证实了这些蛋白之间的相互作用。C/EBPβ包含三个功能域：反式激活域（transactivation domain，TAD，1–104 aa）、调节域（regulatory domain，RD，104–200 aa）和基础亮氨酸拉链域（basic leucine zipper domain，bZIP，210–296 aa）。为确定与OTUD6A相互作用的区域，研究人员构建了三个C/EBPβ截短突变体。在NIH/3T3细胞中将OTUD6A与每个C/EBPβ截短突变体共转染，结果显示，调节域（104–200 aa）缺失消除了相互作用，而TAD或bZIP域的突变不影响OTUD6A结合。
2.7. OTUD6A regulates the stability of C/EBPβ
OTUD6A调控C/EBPβ的稳定性。研究人员旨在确定OTUD6A是否调控C/EBPβ的蛋白水平。在小胶质细胞中沉默OTUD6A，随后用Aβ处理。Aβ暴露导致OTUD6A和C/EBPβ的蛋白表达增加。值得注意的是，敲低OTUD6A降低了C/EBPβ的蛋白表达，而OTUD6A敲低不影响cebpb基因的mRNA表达。这些发现在Aβ灌注的Otud6a KO小鼠和AAV注射的3×Tg-AD模型小鼠中得到进一步验证，支持OTUD6A调控C/EBPβ蛋白稳定性的观点。为进一步确定OTUD6A是否影响C/EBPβ蛋白的稳定性，研究人员进行了放线菌酮实验。OTUD6A过表达延迟了C/EBPβ的降解，表明OTUD6A增强了C/EBPβ蛋白稳定性。随后检查涉及的降解途径，用蛋白酶体抑制剂MG132处理在很大程度上消除了对照组和OTUD6A过表达细胞之间C/EBPβ水平的差异，而溶酶体抑制剂氯喹并未产生可比效果，这表明OTUD6A介导的C/EBPβ稳定性主要与抑制蛋白酶体依赖性降解有关。一致地，在BV2细胞中，MG132而非CQ很大程度上阻断了Aβ相关的C/EBPβ调控。总之，这些数据表明OTUD6A主要通过防止其蛋白酶体依赖性降解来稳定C/EBPβ。既往研究表明，C/EBPβ可激活NF-κB p65，从而促进小胶质细胞中促炎因子的表达。为研究C/EBPβ是否介导OTUD6A的促炎效应，研究人员还检查了OTUD6A敲低对NF-κB p65的影响。结果显示，沉默OTUD6A降低了C/EBPβ表达，进而导致小胶质细胞中NF-κB p65磷酸化减少。这种对NF-κB p65磷酸化的抑制作用也在Aβ灌注的Otud6a KO小鼠和AAV注射的3×Tg-AD小鼠中观察到。此外，免疫荧光染色显示，Aβ促进p65在小胶质细胞核内聚集，而OTUD6A敲低显著减弱了这一效应，进一步支持OTUD6A正向调控NF-κB活化。为进一步测试C/EBPβ是否是OTUD6A介导的炎症信号传导所必需的，研究人员在OTUD6A过表达背景下进行C/EBPβ敲低。如图所示，OTUD6A过表达诱导的p65磷酸化增加因C/EBPβ敲低而显著减弱。一致地，OTUD6A过表达显著增加炎症细胞因子Il1b、Il6和Tnfa的mRNA水平，而在C/EBPβ沉默后这些效应减弱。总之，这些发现表明，OTUD6A至少部分通过稳定C/EBPβ及随后激活NF-κB p65来促进小胶质细胞炎症信号传导。
2.8. OTUD6A regulates C/EBPβ deubiquitinated modification at K253 via K48-linked way
OTUD6A通过K48连接方式调控C/EBPβ在K253位点的去泛素化修饰。为研究OTUD6A是否调控C/EBPβ的去泛素化，研究人员将小胶质细胞共转染HA-泛素、His-C/EBPβ和Flag-OTUD6A表达质粒，并用MG132处理以防止蛋白酶体降解C/EBPβ蛋白，以评估C/EBPβ的泛素化水平。研究发现，小胶质细胞中的OTUD6A降低了C/EBPβ的泛素化。这一结果在NIH/3T3细胞和Aβ注射的Otud6a KO小鼠中得到进一步验证。研究人员接下来试图阐明OTUD6A介导的C/EBPβ去泛素化调控机制。众所周知，去泛素化酶可通过移除标记为蛋白酶体降解的K48连接多泛素链来稳定底物蛋白。结果显示，OTUD6A显著降低了C/EBPβ的K48连接泛素化，而对K63连接泛素化无显著影响。为进一步研究OTUD6A的酶活性，研究人员关注其已知的催化残基C157。表达催化失活突变体（OTUD6A C157A）消除了C/EBPβ的去泛素化，证实了该残基在OTUD6A功能中的关键作用。接下来，研究人员通过网站预测C/EBPβ的泛素化赖氨酸残基，其中K253位点预测评分最高。OTUD6A显著降低野生型C/EBPβ的泛素化水平，而这种效应在K253R突变体中基本消失，表明K253R对OTUD6A介导的去泛素化具有抗性。与此结果一致，OTUD6A增加了野生型C/EBPβ的蛋白水平，但未能同样稳定K253R突变体，进一步支持K253是OTUD6A介导的C/EBPβ稳定所必需的。在功能上，在OTUD6A存在的情况下，K253R突变体诱导p65磷酸化和炎症基因表达的程度不及野生型C/EBPβ。总之，这些发现表明K253是OTUD6A介导的C/EBPβ去泛素化和稳定的关键位点，从而有助于OTUD6A的促炎效应。这些发现表明，OTUD6A的C157活性位点对于通过从C/EBPβ蛋白K253位点去泛素化K48连接的泛素分子以维持C/EBPβ稳定性至关重要。
讨论部分总结指出，该研究证明AD模型小胶质细胞中OTUD6A过表达，且Otud6a KO或小胶质细胞特异性敲低Otud6a可显著抑制AD模型小鼠的神经炎症、认知障碍和神经病理学改变。通过质谱和Co-IP，研究人员确定C/EBPβ是小胶质细胞中OTUD6A的关键底物。机制上，OTUD6A的C157残基去除C/EBPβ K253位点的K48连接泛素链，从而稳定C/EBPβ。此外，敲低C/EBPβ消除了OTUD6A过表达的促炎作用，证实了OTUD6A–C/EBPβ轴在AD发病机制中的重要性。这些发现提示，靶向小胶质细胞OTUD6A可能是AD的新型治疗策略。
随着越来越多证据表明小胶质细胞参与AD病理进展，持续活化的小胶质细胞可导致炎症，炎症性小胶质细胞进一步加剧脑内炎症环境，导致神经细胞损伤。然而，先前尝试使用米诺环素抑制反应性小胶质细胞增生在临床试验中无效，表明需要新策略调控小胶质细胞炎症。近年来，各种DUBs被报道参与AD病理，其中泛素特异性蛋白酶家族备受关注。卵巢肿瘤家族是第二大DUB家族，其成员具有高度保守的半胱氨酸蛋白酶结构域即OTU结构域，与多种疾病相关。近期一些研究报道OTU家族的DUBs也参与AD，例如OTUB1与Tau蛋白相互作用调控AD病理，既往研究也证实YOD1与MYH9相互作用维持其稳定性从而调控小胶质细胞炎症稳态。本研究发现OTUD6A在多种AD模型小胶质细胞中表达显著升高，阐明了该OTU家族DUB在AD神经炎症中的作用及其调控机制。
C/EBP家族转录因子共享一个保守的C端亮氨酸拉链结构域。其中C/EBPβ是调控细胞增殖、分化、代谢和炎症反应的关键转录因子。越来越多证据暗示C/EBPβ是AD神经炎症的重要驱动因素。在活化小胶质细胞中，C/EBPβ上调多种促炎基因，并在小胶质细胞炎症表型中发挥核心作用。一致地，降低C/EBPβ表达的自然化合物已被证明可改善AD相关神经炎症和认知缺陷。然而，这些天然产物并非特异性靶向C/EBPβ，且迄今为止尚未开发出选择性小分子C/EBPβ抑制剂。因此，通过小分子直接靶向C/EBPβ治疗AD具有挑战性。因此，鉴定抑制C/EBPβ的上游特异性靶点可能是更有效方法。既往研究表明OTUD1通过减少神经炎症调控AD中的C/EBPβ。本研究发现OTUD6A在AD小胶质细胞中高度上调，并通过稳定C/EBPβ发挥促炎作用。因此，通过开发小分子抑制剂抑制OTUD6A为间接抑制小胶质细胞C/EBPβ提供了手段，这可能代表AD的一种新型治疗策略。
蛋白泛素化在蛋白稳定性中起重要作用，近期研究表明C/EBPβ泛素化在AD进程中起重要作用。例如，E3泛素连接酶COP1通过在AD小鼠模型中促进C/EBPβ降解来抑制神经炎症并减轻tau病理。另一种E3泛素连接酶Pellino1直接靶向C/EBPβ降解，因此Pellino1缺陷导致C/EBPβ水平升高并增强小胶质细胞吞噬能力。这些E3连接酶靶向的C/EBPβ上的特异性泛素链和泛素化位点尚未明确。本研究发现OTUD6A是C/EBPβ的新型去泛素化酶，其通过其催化C157残基从C/EBPβ移除K48连接泛素。研究人员确定C/EBPβ K253是OTUD6A调控的关键泛素化位点，强调了K253泛素化在控制C/EBPβ稳定性中的重要性。尽管不能排除OTUD6A对C/EBPβ转录活性的影响，但研究结果揭示了调控C/EBPβ的新翻译后机制。这项工作为定义C/EBPβ泛素化图谱奠定基础，并增进了对泛素修饰如何调控C/EBPβ功能的理解。值得注意的是，C/EBPβ上该特异性泛素化位点此前未见报道，鉴定这些位点对未来开发C/EBPβ靶向治疗药物至关重要。
本研究的局限性在于缺乏小胶质细胞特异性OTUD6A敲除小鼠模型。但研究人员通过AAV介导的基因递送在3×Tg-AD小鼠中实现小胶质细胞特异性Otud6a敲低，仍支持了结论。也不能排除OTUD6A存在其他底物促成其效应，这值得进一步研究。迄今为止，尚未报道高选择性OTUD6A抑制剂。开发靶向OTUD6A的小分子抑制剂是未来研究的重要方向。鉴定的对C/EBPβ去泛素化至关重要的OTUD6A C157催化位点，为理性药物设计提供了依据。破坏蛋白-蛋白相互作用是另一种治疗策略。研究发现OTUD6A特异性结合C/EBPβ的RD结构域。因此，设计干扰OTUD6A–C/EBPβ相互作用界面的分子可能是减弱AD小胶质细胞炎症的新方法。除C/EBPβ外，蛋白质组学筛选还鉴定出其他几个高排名的OTUD6A相关候选物，包括Lima1、Actg1、Kdm5a、Sptan1、Alyref、Actn1、Polr1c和Dync1li1。其中许多参与细胞骨架组织、转录/表观遗传调控、RNA代谢或细胞内运输，表明OTUD6A可能具有超出C/EBPβ轴的更广泛调控功能。虽然本研究在多个成熟的AD小鼠模型中确定了OTUD6A在小胶质细胞中的调控作用，一个重要局限性是缺乏死后人类AD脑组织验证。因此，OTUD6A失调在人类AD中的转化相关性仍有待确定。尽管如此，当前数据为实验性AD环境中小胶质细胞OTUD6A功能提供了机制见解。未来使用人死后脑样本和细胞类型特异性分析的工作，将有必要确定在小鼠模型中观察到的变化是否在人类AD中保守。
研究结论翻译：
我们的研究表明，AD模型小胶质细胞中OTUD6A过表达，且Otud6a KO或小胶质细胞特异性敲低Otud6a可显著抑制AD模型小鼠的神经炎症、认知障碍和神经病理学改变。通过质谱和Co-IP，我们鉴定出C/EBPβ是小胶质细胞中OTUD6A的关键底物。机制上，OTUD6A的C157残基去除C/EBPβ K253位点的K48连接泛素链，从而稳定C/EBPβ。此外，敲低C/EBPβ消除了OTUD6A过表达的促炎作用，证实了OTUD6A–C/EBPβ轴在AD发病机制中的重要性。这些发现提示，靶向小胶质细胞OTUD6A可能是AD的新型治疗策略。
