ALA-PDT通过mtDNA释放介导的cGAS-STING通路激活诱导HPV转化细胞凋亡

《Photodiagnosis and Photodynamic Therapy》：ALA-PDT Induces Apoptosis in HPV-transformed Cells through mtDNA Release-Mediated Activation of the cGAS-STING Pathway

　　

氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）是治疗HPV相关疾病的有效且非侵入性手段，但其潜在机制仍需进一步探究。cGAS-STING信号通路参与抗病毒天然免疫防御，然而其在ALA-PDT治疗中的变化及调控机制尚不清楚。在HPV转化细胞中，研究人员通过qPCR检测线粒体DNA（mtDNA）的相对表达量，利用共聚焦显微镜观察细胞形态及线粒体与DNA的空间关系，通过蛋白质印迹法（western blot）评估cGAS-STING通路相关蛋白表达，并以流式细胞术检测细胞凋亡情况，同时进行相应的统计分析。研究结果显示，ALA-PDT处理可诱导mtDNA释放入HeLa细胞胞质并激活cGAS-STING通路，表现为cGAS和STING表达上调，并促进细胞凋亡（P < 0.05）。此外，STING的药理学抑制可减弱该效应。值得注意的是，在mtDNA耗竭（ρ⁰）细胞中，ALA-PDT诱导的cGAS-STING反应显著减弱，提示ALA-PDT的免疫刺激效应可能通过mtDNA释放介导。研究结论表明，ALA-PDT能够诱导mtDNA从线粒体释放至胞质，进而激活HPV感染HeLa细胞中的cGAS-STING信号通路。这些结果有助于拓展对ALA-PDT干预机制的认识，并可能为进一步探索新型光动力、光免疫及光免疫基因疗法提供参考。

人乳头瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）是一种无包膜双链DNA病毒，在人类分化皮肤细胞中复制，人类为其唯一自然宿主。氨基酮戊酸光动力疗法（5-aminolevulinic acid photodynamic therapy, ALA-PDT）是基于光敏剂介导和光诱导细胞毒性的非侵入性治疗方法，在HPV相关感染治疗中显示出令人满意的临床疗效，具有高病毒清除率、低复发率和轻微不良反应等特点。近期研究表明，ALA-PDT可诱导靶组织产生炎症反应，促进免疫细胞募集并进一步激活机体免疫应答。环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（Cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）是一种天然免疫感受器，可识别多种胞质双链DNA分子，包括来源于病毒、凋亡、外泌体、线粒体、微核及逆转录元件的DNA。干扰素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes, STING）是一种内质网（Endoplasmic reticulum, ER）驻留膜蛋白，也可通过其N端跨膜结构域部分定位于线粒体及线粒体相关膜。与dsDNA结合后，cGAS形成2:2复合物并催化ATP和GTP合成第二信使2',3'-cGAMP。cGAMP随后刺激STING从内质网向高尔基体转位，并在该处发生棕榈酰化。继而STING作为TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1, TBK1）和IκB激酶（IκB kinase, IKK）的平台，分别导致IRF3和p50/RelA复合物的活化及核转位。这些转录因子协同刺激I型干扰素及其他免疫刺激基因的表达。cGAS-STING-IFN通路参与抗病毒防御，可诱导包括凋亡、坏死、焦亡和细胞衰老在内的多种细胞死亡形式。cGAS对于抗DNA病毒如HSV-1和KSHV的I型干扰素应答至关重要，也有助于抗正义单链RNA病毒如西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV）的天然免疫。肿瘤细胞中由损伤产生的胞质DNA被cGAS识别，激活STING通路并上调I型IFNs、干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）及衰老相关分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype, SASP）基因的表达。cGAS-STING可活化混合谱系激酶结构域样蛋白（Mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL），MLKL寡聚化破坏质膜完整性导致细胞死亡，同时促进p53上调凋亡调控因子（p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA）的活化，加速mtDNA向胞质释放，进一步促进凋亡。近期研究揭示mtDNA可结合并激活cGAS。mtDNA逃逸的系统研究始于20世纪90年代，Thorsness和Fox在酿酒酵母中的研究首次证明mtDNA可从线粒体基质转位至细胞核，且核基因突变可增加此类逃逸事件的频率。mtDNA也可通过线粒体或溶酶体通透化由线粒体自噬、自噬或膜运输缺陷等途径释放。mtDNA是激活cGAS的潜在胞质自身DNA来源。尽管ALA-PDT在靶组织中的炎症反应已被研究，但其治疗性光免疫基因机制，包括mtDNA-cGAS-STING通路，仍不明确，需进一步探索。

研究人员以HPV-18整合转化的HeLa细胞作为慢性持续性HPV感染病变细胞的体外模型，该细胞系含完整HPV-18基因组，经短串联重复序列（Short tandem repeat, STR）鉴定及支原体检测确认。实验样本还包括南方医科大学南方医院外科切除的尖锐湿疣（Condyloma acuminatum, CA）组织标本（n=3）及健康男性包皮组织作为对照。主要关键技术方法包括：免疫组织化学染色检测CA与正常组织中cGAS-STING通路关键分子表达差异；以溴化乙锭（Ethidium bromide, EtBr）处理建立mtDNA耗竭（ρ⁰）细胞模型，并通过CCK-8细胞毒性实验确定适宜浓度；CCK-8法检测不同ALA浓度、光能量密度及STING拮抗剂H-151对细胞相对代谢活性的影响，筛选出接近半数抑制浓度（IC₅₀）的实验条件（0.5 mmol/L ALA联合0.3 J/cm²光能量）；采用digitonin缓冲液进行亚细胞组分分离，提取胞质及沉淀组分DNA，以定量实时PCR（Quantitative real-time PCR, qPCR）检测胞质mtDNA相对表达量；免疫荧光实验以MitoTracker Red CMXRos标记线粒体、抗DNA抗体标记DNA、H????33342标记细胞核，通过激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体与DNA的定位关系；蛋白质印迹法检测cGAS-STING通路相关蛋白表达；以及采用Annexin V-FITC/碘化丙啶（Propidium iodide, PI）双染流式细胞术检测细胞凋亡率。

研究结果部分，"尖锐湿疣组织中cGAS-STING通路的激活"显示，通过免疫组织化学染色发现，CA组织中STING、IRF3和NF-κB呈弥漫性强阳性表达，阳性率超过80%，而正常包皮组织中仅局限于基底层表达，提示CA组织中存在STING通路激活；但cGAS在CA与对照组织中均局限于基底层表达，TBK1则在两者表皮全层均高表达。

"生成mtDNA耗竭（ρ⁰）细胞的最佳溴化乙锭浓度确定"表明，经梯度EtBr浓度处理一周后，80 ng/mL组在维持相对细胞代谢活性超过98%的同时mtDNA相对表达量最低，故选取该浓度处理一周用于后续ρ⁰细胞制备。

"ALA-PDT以浓度和能量依赖性方式抑制细胞相对代谢活性及最佳条件确定"显示，0.5 mmol/L ALA联合0.3 J/cm²光能量时HeLa细胞相对代谢活性约为50%，接近IC₅₀，该组合被选用于后续实验。

"STING拮抗剂H-151的最佳实验浓度确定"发现，0 μM至10 μM浓度范围内H-151对细胞相对代谢活性无显著差异，故选取该范围内浓度进行后续实验。

"ALA-PDT介导mtDNA释放入胞质"显示，与空白对照相比，ALA-PDT组胞质mtDNA水平显著升高且超过H₂O₂阳性对照组，而各组总细胞mtDNA水平无显著差异；共聚焦显微镜观察显示ALA-PDT组胞质绿色荧光增强、与线粒体共定位的橙色荧光减少，且出现核固缩和染色质浓缩等凋亡形态学改变，ρ⁰细胞未见mtDNA释放。

"ALA-PDT激活cGAS-STING信号通路"表明，ALA-PDT组STING、cGAS和p-TBK1蛋白水平较空白对照、单纯光照及单纯ALA组显著上调；STING拮抗剂H-151预处理后，ALA-PDT诱导的pTBK1、STING蛋白表达下调，Bcl-2表达上调，高剂量H-151还抑制cGAS表达。

"ALA-PDT激活cGAS-STING通路促进HPV转化细胞凋亡"显示，流式细胞术检测ALA-PDT组凋亡率显著增加，H-151联合处理组凋亡率较ALA-PDT单独处理降低，与蛋白质印迹法中Bcl-2下调结果一致。

"释放的mtDNA激活cGAS-STING通路并促进HPV转化细胞凋亡"表明，与空白对照相比，ρ⁰细胞中cGAS和pTBK1蛋白水平显著降低，TBK1亦呈下降趋势；ρ⁰与ρ⁰+ALA-PDT组间cGAS、STING、pTBK1及TBK1水平无明显差异，凋亡率亦无显著差异；CCK-8结果显示ρ⁰+ALA-PDT组相对细胞代谢活性虽低于ρ⁰组，但高于ALA-PDT组，证实mtDNA缺失部分削弱了ALA-PDT效应。

讨论部分，研究人员指出cGAS-STING通路是抗病毒感染、抗肿瘤免疫等过程中古老且保守的机制。通过免疫组织化学首次发现CA组织中STING及其下游分子显著上调，提示该通路可能在抗HPV感染防御中发挥关键作用；而cGAS在疣组织中未显著变化，结合HPV与细胞膜融合时宿主细胞膜扰动或钙内流也可触发STING激活的研究，提示HPV可能通过cGAS非依赖性机制激活STING通路。线粒体作为天然免疫关键调节因子的角色已被广泛认可，mtDNA释放至胞质、胞外或循环中可激活多种天然免疫DNA/RNA感受器。已明确的mtDNA释放机制包括：BAK/BAX孔介导的线粒体内膜（Inner mitochondrial membrane, IMM）出芽；线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore, mPTP）和电压依赖性阴离子通道（Voltage-dependent anion channel, VDAC）参与的mtDNA逃逸；以及线粒体自噬、自噬或膜运输缺陷导致的线粒体或溶酶体渗漏。研究人员既往研究表明ALA-PDT可诱导HPV转化细胞凋亡、焦亡和自噬，且作用后产生大量活性氧（Reactive oxygen species, ROS）。鉴于mPTP是钙离子和氧化剂调控的线粒体内膜孔道，ALA-PDT产生的ROS可导致mPTP和VDAC协同作用，使mtDNA以片段形式通过mPTP和VDAC孔释放入胞质；在凋亡或焦亡条件下，mtDNA也可通过BAK/BAX孔以完整核样体形式挤出，或通过Gasdermin孔以较小片段逃逸。本研究证实ALA-PDT处理后HeLa细胞胞质mtDNA相对水平升高，可进一步激活cGAS-STING通路及IFNs、NF-κB等表达。在cGAS-STING通路中，活化的IRF3可与Bax结合直接诱导凋亡。研究人员发现ALA-PDT处理的HeLa细胞高表达DNA感受器cGAS和中心接头蛋白STING，抗凋亡蛋白Bcl-2下调，凋亡细胞比例显著增加，提示ALA-PDT可能通过增加胞质dsDNA量激活cGAS-STING通路，对抗E7的拮抗作用并最终导致HeLa细胞凋亡。H-151作为有效的选择性共价STING拮抗剂，在研究人员实验中发现低剂量即可拮抗STING、下调pTBK1并抑制凋亡，高剂量还抑制cGAS活化，进一步证实ALA-PDT激活cGAS-STING通路。mtDNA释放的总量和物理状态是天然免疫识别的关键决定因素，通过抑制mtDNA复制减少总量或阻断释放通道可降低cGAS-STING通路激活。本研究以80 ng/mL EtBr处理一周建立ρ⁰细胞模型，qPCR证实mtDNA水平显著降低；ρ⁰细胞中cGAS-STING通路及其下游蛋白表达显著下调，ALA-PDT处理后上述蛋白水平无明显变化，凋亡率亦无明显改变，表明mtDNA缺失阻止了ALA-PDT激活cGAS-STING通路，揭示ALA-PDT通过释放mtDNA激活cGAS进而诱导HPV转化细胞凋亡。

研究结论部分翻译如下：本研究证实ALA-PDT可诱导mtDNA从线粒体释放至胞质，进而激活HPV感染HeLa细胞中的cGAS-STING信号通路。这些结果有助于拓展对ALA-PDT干预机制的认识，并可能为进一步探索新型光动力、光免疫和光免疫基因疗法提供参考。具体而言，本研究明确了该治疗潜在免疫激活效应的分子水平理论依据。探索ALA-PDT与特定调节剂（如STING激动剂）联合应用以实现协同效应、进一步加强对HPV转化病变的破坏具有重要的临床意义。