利用来自草莓（Fragaria × ananassa）、黑莓（Rubus idaeus）和越橘（Vaccinium corymbosum）叶片上的附生细菌对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）进行生物防治

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Biocontrol of Botrytis cinerea in strawberry using epiphytic bacteria from Fragaria × ananassa, Rubus idaeus and Vaccinium corymbosum leaves

　　

穆罕默德·拉迪（Mohammed Radi）|穆罕默德·陶西（Mohammed Taoussi）|伊克拉姆·莱格里菲（Ikram Legrifi）|穆罕默德·卡迪里（Mohammed Khadiri）|哈立德·勒克比尔（Khalid L’Kbir）|海塔姆·拉赫马姆西（Haitam Lahmamsi）|巴德尔埃丁·德里斯（BadrEddine Drissi）|曼苏尔·索贝（Mansour Sobeh）|贾马尔·伊比吉比詹（Jamal Ibijbijen）|莱拉·纳西里（Laila Nassiri）|拉希德·拉哈拉利（Rachid Lahlali）

摩洛哥梅克内斯国立农业大学植物保护系，植物病理学单元，Haj Kaddour路10公里处，邮政信箱S/40，梅克内斯50001

摘要

由Botrytis cinerea引起的灰霉病是限制草莓生产的主要采后病害。在这项研究中，从Fragaria × ananassa、Rubus idaeus和Vaccinium corymbosum的叶片中分离出78株附生细菌，并对其对抗B. cinerea的活性进行了筛选。其中17株细菌在体外实验中表现出超过70%的显著抑制作用（p < 0.05），其中Bacillus amyloliquefaciens菌株MR7的菌丝生长抑制效果最高（88.96%）。分子鉴定显示，最有效的菌株主要属于Bacillus属。在离体果实实验中，MR7将灰霉病的严重程度显著降低到约10%，与杀菌剂difenoconazole的效果相当。温室实验进一步证实了MR7的拮抗潜力，其使病害严重程度降至12.15%，而未处理对照组为88.19%。此外，经MR7处理的果实保持了更高的硬度、总可溶性固形物含量、可滴定酸度和成熟度指数。生化分析表明这些细菌产生了水解酶、挥发性化合物和可扩散代谢物，并含有脂肽生物合成基因，这些因素可能与其拮抗活性有关。FTIR和LC-MS分析提供了初步证据，表明处理过的果实结构降解和细胞外代谢物多样性有所减少。总体而言，研究结果表明附生Bacillus菌株，特别是B. amyloliquefaciens MR7，是草莓灰霉病生物防治的有希望的候选菌株，为进一步的机制研究和制剂开发提供了依据。

引言

草莓（Fragaria × ananassa Duchesne）是全球经济上最重要且消费最广泛的小型水果之一，因其独特的香气和风味以及丰富的营养价值而受到重视[1]、[2]。草莓是一种极易腐烂的作物，由于质地脆弱、呼吸速率高和含水量高，对采后劣化非常敏感[3]。多种真菌、病毒和细菌病原体的侵袭会严重降低草莓产量[4]。在草莓的真菌病害中，灰霉病是最普遍且最具经济破坏性的[5]。该病害由坏死性子囊菌B. cinerea Pers. ex Fr.（以前称为Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel）引起[6]。

由B. cinerea引起的灰霉病在全球造成了巨大的经济损失，估计每年损失在100亿至1000亿美元之间，使其成为影响草莓和其他软果类的最具破坏性的采后病害之一[7]。在美国，草莓年产量超过23亿美元，B. cinerea是导致这些损失的主要采后病原体[5]。在缺乏杀菌剂保护的潮湿条件下，草莓上的灰霉病会更加严重，花和果实的感染率常常超过80%，这主要是由于B. cinerea的孢子大量萌发和快速定殖所致。衰老的花瓣和雄蕊是主要的接种源，通过直接接触引发超过64%的感染，尤其是在湿度较高的密集果园中[5]。这表明，在采前阶段有效的病害管理并不一定能保证采后腐烂得到充分控制[8]。

化学杀菌剂是限制采后果实腐烂的最廉价方法之一[9]。然而，大量研究表明，整个生长季节频繁和重复使用化学杀菌剂会导致病原体抗性的产生以及果实中有毒残留物的积累[10]、[11]。此外，喷洒在田间的杀菌剂会被水冲走或渗入土壤，从而导致环境污染[12]。

过去十年中，生物防治研究发现了许多细菌拮抗剂，特别是Bacillus属菌株，如B. subtilis、B. licheniformis、B. amyloliquefaciens、B. halotolerans和Paenibacillus polymyxa，它们通过多种机制（如抗菌作用、挥发性代谢物和可扩散代谢物、营养竞争以及诱导抗性）对B. cinerea表现出高抑制率[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。最近针对草莓果实的内生和附生Bacillus菌株的研究表明，它们能够有效预防灰霉病并保持果实品质，符合采后管理的目标[18]、[19]、[20]、[21]。这些细菌不仅对B. cinerea有效，对所有真菌病原体都有效，主要通过产生脂肽、挥发性代谢物、在果实/叶片表面竞争排斥、酶介导的菌丝损伤以及激活植物防御反应来发挥作用，这些机制通常在同一菌株中同时存在[17]、[22]。自然存在于植物组织表面的细菌代表了潜在的生物防治剂来源。这些细菌很好地适应了叶际环境，并采用多种防御策略对抗病原体，包括营养和空间竞争、产生抗真菌化合物、分泌水解酶以及诱导植物防御反应[7]、[23]。

本研究的目的是评估从草莓（Rubus idaeus）和蓝莓（Vaccinium corymbosum）叶片中分离出的附生Bacillus菌株作为生物防治剂对抗草莓灰霉病的潜力。通过体外实验、温室条件下的田间试验以及采后果实实验来评估其拮抗活性，以确定有效的灰霉病生物防治剂。

章节片段

B. cinerea的分离与分子鉴定

B. cinerea菌株BRC1是从表现出典型灰霉病症状的草莓叶片和果实（Fragaria × ananassa）中分离得到的，症状包括柔软的棕色病斑、水浸状组织和灰色的孢子菌丝[24]。使用无菌手术刀无菌切除0.5–1厘米的感染组织片段，用70%乙醇表面消毒10–30秒，然后浸入2%次氯酸钠溶液中5分钟。随后用无菌蒸馏水冲洗三次，晾干

附生细菌的筛选

从加尔布地区不同区域收集的叶片样本中分离出78株附生细菌，并在LB培养基上培养。在78株细菌中，通过筛选发现17株对B. cinerea具有显著的抗真菌活性（图1），抑制率超过70%（p<0.05）。进一步进行了体外生物防治测试，首先进行了双菌对抗实验

讨论

鉴于杀菌剂抗性的增加和残留问题，本研究评估了浆果叶际附生细菌作为采后B. cinerea生物防治剂的潜力。过去十年中，细菌拮抗剂，尤其是Bacillus属菌株（如B. subtilis、B. licheniformis、B. amyloliquefaciens、B. halotolerans和Paenibacillus polymyxa，通过抗菌作用、挥发性代谢物和可扩散代谢物、营养竞争以及诱导抗性等方式，始终表现出对B. cinerea的有效性

结论

本研究显示，从三种浆果植物（草莓、树莓、蓝莓）叶片中分离出的附生细菌菌株对引起草莓灰霉病的B. cinerea具有重要的生物防治潜力。在78株菌株中，有17株在体外实验中表现出显著的抗真菌活性，其中B. amyloliquefaciens MR7、B. siamensis MR12、B. tequilensis MR14、B. velezensis MR19和B. mojavensis MR26的活性最强。这些菌株具有广泛的

作者贡献声明

哈立德·勒克比尔（Khalid L’Kbir）：撰写初稿、软件使用、数据分析。海塔姆·拉赫马姆西（Haitam Lahmamsi）：撰写初稿、软件使用、数据分析。巴德尔埃丁·德里斯（BadrEddine Drissi）：撰写初稿、软件使用、数据分析。曼苏尔·索贝（Mansour Sobeh）：撰写与编辑、方法学设计、数据分析、概念构思。贾马尔·伊比吉比詹（Jamal Ibijbijen）：撰写与编辑、验证、监督、软件使用、方法学设计。莱拉·纳西里（Laila Nassiri）：撰写与编辑

[50]。

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

数据可应要求提供。

本研究得到了MESRSI在Core Organic CoFund（2021年，ResBerry项目）下的财政支持

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

作者感谢梅克内斯国立农业大学的研究人员和工作人员对这项工作的贡献。