基于延伸因子1-α（tef1）基因的实时荧光重组酶聚合酶扩增（Real-time Fluorescent RPA）检测柑橘黑斑病菌（Phyllosticta citricarpa）方法的建立与分析验证

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Development and analytical validation of a fluorescent recombinase polymerase amplification-assay for real-time detection of Phyllosticta citricarpa, the causative agent of Citrus Black Spot

　　

摘要：柑橘黑斑病（Citrus Black Spot, CBS）由真菌Phyllosticta citricarpa引起，是该病害的重要诊断对象，其病原为欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）区域受监管检疫性有害生物并需实施监测。为开发快速分子检测方法，研究人员通过序列比对及计算机（in-silico）特异性分析，建立了靶向P. citricarpa tef1基因134 bp区域的实时荧光重组酶聚合酶扩增（Real-time Fluorescence RPA/RPA）检测体系。该检测体系对P. citricarpa具有分析特异性，对诊断相关的非靶标柑橘相关病原（包括Phyllosticta capitalensis和P. citriasiana）无交叉扩增。以质粒及纯化基因组DNA（gDNA）评估分析灵敏度，可检出低至1.0×10?7ng/μL质粒（约100拷贝/反应）及3.5×10?3ng gDNA/反应（约113个基因组拷贝）。进一步在掺入P. citricarpa菌丝的柑橘果皮粗提物中验证，在甜橙（Citrus sinensis）、柠檬（C. limon）和柑（C. reticulata）基质中均可可靠检出至1.0 mg/mL。与EPPO推荐的TaqMan qPCR（Van Gent-Pelzer法）进行性能比对，显示灵敏度相当，且操作简便、对扩增抑制物耐受性强。该体系可在柑橘果皮粗提物中直接检测P. citricarpa，配合低温下快速实时荧光读出及最低设备要求，为柑橘植物基质中该病原菌提供一种简便、快速的分子检测手段。

论文解读——《Physiological and Molecular Plant Pathology》刊载研究：Phyllosticta citricarpa实时荧光RPA检测方法的建立与验证

一、研究背景与意义

柑橘黑斑病（Citrus Black Spot, CBS）由子囊菌Phyllosticta citricarpa（原名Guignardia citricarpa）引起，是柑橘产业重大检疫性真菌病害。P. citricarpa在欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）区域被列为检疫性有害生物，欧盟成员国尚未有其定殖分布，因此对进口柑橘果实及寄主植物实施严格限制与监测。现有EPPO推荐的诊断方法是Van Gent-Pelzer等人建立的基于核糖体DNA内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）的TaqMan实时荧光定量PCR（Real-time PCR/qPCR），ITS为多拷贝基因，灵敏度较高，但存在与近缘种（如广泛存在于柑橘上的内生菌Phyllosticta capitalensis及仅侵染柚的P. citriasiana）交叉扩增的问题，可能导致假阳性。虽已有基于延伸因子1-α（translation elongation factor 1-alpha, tef1）的qPCR可提高特异性，但仍依赖DNA纯化及热循环仪。环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）也存ITS靶标特异性不足及需纯化DNA之局限。重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）系一种等温核酸扩增技术，可在37–42℃恒温数分钟至数十分钟内完成扩增，兼容粗提植物基质，适合现场或资源受限条件下的快速检测，但目前尚无针对P. citricarpa适用于柑橘果皮粗提物的RPA检测体系。为此，研究人员建立并分析验证了靶向tef1基因的单拷贝区域之实时荧光RPA（Real-time Fluorescent RPA）检测体系，并与EPPO标准qPCR进行比对评价。

二、主要关键技术方法

研究人员选取多株地理来源不同的P. citricarpa及近缘Phyllosticta spp.（含P. paracitricarpa、P. capitalensis、P. citriasiana）和其他常见柑橘相关病原真菌及卵菌（Alternaria、Colletotrichum、Fusarium、Penicillium、Plenodomus tracheiphilus、Phytophthora等），提取基因组DNA（gDNA）。经多序列比对从tef1基因中筛选P. citricarpa特异134 bp片段，设计RPA引物与Twist Amp exo探针（THF位点两侧标记FAM及暗淬灭基团dT-Q，3'端C3-Spacer封闭）。RPA反应于39℃恒温扩增20 min，采用实时荧光检测仪记录时间至阳性（Time to Positivity, Tp）。以含靶序列的TOPO克隆质粒10倍系列稀释及P. citricarpa分离株1G纯化gDNA系列稀释评估分析灵敏度，以Probit回归估算95%检出限（Limit of Detection, LoD）。以掺入不同浓度P. citricarpa新鲜菌丝之甜橙、柠檬、柑果皮粗研磨裂解液（AMP1缓冲液处理离心取上清）评估基质耐受性。同步以Van Gent-Pelzer TaqMan qPCR作对照，评价特异性（ inclusivity/exclusivity）及灵敏度。

三、研究结果

3.1. Assay design and preliminary specificity tests（检测体系设计及初步特异性测试）

经NCBI BLAST比对确认所选134 bp tef1条形码对P. citricarpa具100%一致性，最近非靶标P. paracitricarpa相似度97.76%。常规PCR预实验显示P. citricarpa及P. paracitricarpa可扩增，其余测试种无扩增，据此加入实时荧光探针完成RPA体系构建。

3.2. Specificity of the RPA assay（RPA检测体系特异性）

RPA对所有测试P. citricarpa菌株（突尼斯、巴西、澳大利亚来源）及原定为P. paracitricarpa菌株呈阳性，对柑橘宿主gDNA、P. capitalensis、P. citriasiana及其他非靶标真菌与卵菌均呈阴性，无非特异性扩增。对照EPPO推荐之Van Gent-Pelzer TaqMan qPCR除扩增P. citricarpa与P. paracitricarpa外，还对P. citriasiana及P. capitalensis呈阳性，显示本研究RPA具更优排他性（Exclusivity），且近期系统发育基因组学支持P. paracitricarpa为P. citricarpa种内变异（即P. citricarpa sensu lato），故共扩增具分类学合理性。

3.3. Sensitivity of the RPA assay（RPA检测体系灵敏度）

以含靶序列质粒标准品10倍系列稀释进行RPA，标准曲线在7个数量级内呈线性，最低检出为1.0×10^?7ng/μL质粒DNA（约100质粒拷贝/反应）。以P. citricarpa 1G株纯化gDNA系列稀释，RPA最低可检出3.5×10^?3ng gDNA/反应（约113基因组拷贝），95% LoD为7.52×10^?3ng gDNA（置信区间CI：4.58×10^?3–1.23×10^?2ng）。同批gDNA之Van Gent-Pelzer qPCR最低检出为1.0×10^?4ng，95% LoD为2.28×10^?3ng（CI：6.93×10^?4–7.49×10^?3ng），二者LoD置信区间重叠，因qPCR靶标为多拷贝ITS而RPA靶标为单拷贝tef1，此灵敏度差异符合预期。基质耐受测试中，RPA在甜橙、柠檬及柑果皮粗提物中均可稳定检出低至1.0 mg/mL掺入菌丝，95% LoD分别为橙皮粗提物约5.58 mg/mL（CI：1.22–25.35 mg/mL）、柠檬皮粗提物约8.79 mg/mL（CI：1.95–39.59 mg/mL）、柑皮粗提物约7.12 mg/mL（CI：1.56–32.40 mg/mL），表明该RPA体系可耐受柑橘果皮中抑制物并在未纯化粗提物中维持检测能力。

四、讨论与结论总结（Conclusion部分译文）

综上所述，本研究通过开发靶向P. citricarpa tef1基因的实时荧光RPA检测体系，拓展了柑橘黑斑病分子诊断工具箱。该检测体系结合了快速等温扩增、选择性靶标检测及对复杂柑橘来源基质的耐受性，同时保持符合实用分子检测要求的检测性能。采用tef1为靶标提升了与多种近缘非靶标Phyllosticta种的区分能力，且在柑橘果皮粗提物中成功扩增，凸显了该RPA体系用于柑橘相关植物基质中P. citricarpa快速分子检测的潜力。