向日葵NAC84赋予植物盐旱耐受性及增产潜力

《Plant Physiology and Biochemistry》：Sunflower NAC84 confers plant salt and drought tolerance and yield-increasing potential

　　

干旱和盐胁迫对全球粮食安全构成严重威胁。然而，通过单个基因的过表达来增强作物抗逆性常常导致与其他农艺性状之间的权衡。因此，鉴定能够同时增强抗逆性和产量的等位基因是一项关键 priorities。向日葵（Helianthus annuus L.）因其显著的盐和干旱耐受性，常被选为盐碱地改良的先锋物种。NAC蛋白作为植物特有的转录调控因子，在调控形态建成和介导各种胁迫耐受性方面发挥着核心作用。研究人员报道了HaNAC84赋予盐旱胁迫耐受性并表现出增产潜力。HaNAC84在拟南芥中的稳定过表达和在向日葵中的瞬时表达均显著提高了盐旱耐受性。机制上，HaNAC84增强了关键抗氧化酶（SOD、POD、CAT、GR）的活性并提升了整体抗氧化能力，从而限制活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累并保护膜完整性。在拟南芥中，HaNAC84上调了POD、CAT和P5CS基因转录，激活了脱落酸（abscisic acid, ABA）生物合成和信号传导以促进气孔关闭，并诱导了下游防御基因（NHX1、DREB2A、LEA3、RD29A）的表达。除胁迫保护外，HaNAC84还促进了根伸长和分枝，提高了光合效率，并最终在正常和胁迫条件下均增加了种子产量。综上所述，研究发现HaNAC84是工程化改良抗逆作物以维持日益增加的 abiotic stress 下生产力的有前景的靶标。

干旱和盐分是制约全球作物生产的主要非生物胁迫因子，严重威胁粮食安全。传统通过过表达单个胁迫相关基因来增强作物抗逆性的策略常伴随生长抑制或产量下降的代价，因此筛选能同时提升抗逆性与产量的优异等位基因成为分子育种的关键方向。向日葵作为世界主要油料作物之一，具有耐旱、耐盐碱特性，是边际土地改良的理想先锋物种，但其生长发育和产量仍易受到干旱和盐胁迫的严重影响。NAC（NAM、ATAF、CUC）转录因子家族作为植物特有的重要调控因子，在协调发育程序与逆境响应中发挥核心作用，但向日葵中NAC基因的功能研究尚处于起步阶段。

研究人员从向日葵品种"Zaoaidatou"中克隆了SNAC亚族基因HaNAC84，该基因开放阅读框为993 bp，编码331个氨基酸的蛋白质，在盐和干旱复合胁迫下显著上调表达。通过生物信息学分析，HaNAC84与已知参与非生物胁迫适应的转录因子（如PeNAC036、CarNAC4、SlNAC10/11）以及根系发育相关蛋白（如GmNAC003/004、GhSNAC3）聚类；其启动子区域包含多种胁迫响应元件（STRE、DRE1、MBS、MYC、ARE、W-box）、激素响应元件（ABRE、AuxRR-core）及光响应元件。亚细胞定位实验证明HaNAC84定位于细胞核，酵母自激活实验证实其具有转录激活活性。

研究人员采用向日葵瞬时转化系统（过表达OE、RNA干扰RNAi及空载体EV对照）和拟南芥稳定转化系统（T3代纯合过表达株系OE13和OE15）开展功能研究。胁迫处理包括：向日葵幼苗用350 mM NaCl或400 mM甘露醇处理72小时；拟南芥成株用300 mM NaCl处理7天或自然干旱12天后复水3天；基因表达分析采用300 mM NaCl或20% PEG 6000处理24小时。

关键实验技术包括：生物信息学与系统进化分析（MEGA 7软件最大似然法）、亚细胞定位（洋葱表皮细胞瞬时表达融合蛋白）、转录自激活分析（酵母双杂交系统）、qRT-PCR基因表达分析、植物遗传转化（农杆菌介导的向日葵瞬时转化和拟南芥稳定转化）、生理指标测定（DAB/NBT/台盼蓝染色、MDA/T-AOC/脯氨酸含量及CAT/SOD/POD/GR酶活性、ABA含量ELISA检测）、种子萌发与根系分析、光合参数测定（IMAGING-PAM荧光仪测定Fv/Fm、Φ_PSII、rETR；便携式光合仪测定A、G_s、Ci）、叶片失水率与气孔开度分析，以及统计分析（Duncan多重比较）。

**HaNAC84显著响应盐旱胁迫**

HaNAC84在向日葵叶片和根系中受到盐、干旱、极端温度、甲基紫精及ABA、SA、MeJA等多种胁迫和激素诱导而上调表达。作为核定位的转录激活因子，其系统进化位置暗示其可能参与胁迫适应和根系发育调控。

**HaNAC84赋予向日葵和拟南芥盐旱复合耐受性**

在向日葵瞬时转化实验中，HaNAC84-OE幼苗在盐旱胁迫下保持更绿，而RNAi株系萎蔫更严重；OE株系ROS积累减少（DAB/NBT染色减弱）、膜损伤降低（台盼蓝染色变浅）、MDA含量显著下降，同时SOD、POD、CAT、GR活性及T-AOC显著升高，而RNAi株系呈现相反表型。在拟南芥稳定转化体系中，HaNAC84-OE株系在盐旱胁迫下的种子萌发率、子叶绿化率和幼苗根长均显著优于野生型；成株期盐胁迫下转基因植株生长更佳、萎蔫更轻，干旱复水后存活率显著高于野生型（>70% vs ~50%）。生理层面，转基因株系抗氧化能力增强（MDA降低、CAT活性升高、POD和CAT基因上调），渗透调节物质脯氨酸积累增加并伴有P5CS基因上调。

**HaNAC84激活胁迫响应基因增强盐旱耐受性**

在盐和干旱胁迫下，HaNAC84-OE拟南芥中NHX1、DREB2A、LEA3、RD29A等防御基因以及NCED3、ABI1、ABI5、RAB18等ABA通路基因均显著上调表达。其中NCED3上调与干旱下ABA含量增加相关，ABI1和ABI5的上调增强了ABA信号传导。

**HaNAC84通过调控ABA敏感性和气孔开度增强干旱耐受性**

ABA响应实验中，无外源ABA时各株系萌发和根系生长无显著差异，但添加外源ABA后HaNAC84-OE株系表现出更低的子叶绿化率和更短的根长，显示其对ABA敏感性增强。气孔分析显示，30 μM ABA处理后野生型约30%气孔仍完全开放，而HaNAC84-OE仅约10%开放，且转基因株系完全关闭气孔比例显著更高。结合NCED3、ABI1、ABI5上调及内源ABA升高的结果，表明HaNAC84通过增强ABA敏感性促进气孔关闭来节约水分。

**HaNAC84过表达增强正常和胁迫条件下的光合性能**

在正常及盐旱胁迫条件下，HaNAC84-OE拟南芥的Fv/Fm、Φ_PSII、rETR、A、G_s和Ci等光合参数均高于野生型，表明光反应效率提高、光合能力提升，从而在水分亏缺下维持更优的气体交换性能。

**HaNAC84增加转基因拟南芥种子产量**

HaNAC84-OE株系在营养生长期表现出更多的莲座叶数和更大的叶片社工直径；生殖期具有更强的整体生长势，包括更大的叶片和更发达的根系。转基因植株的株高、抽薹分枝数、干重均显著增加；角果数增多且更大更长，种子数量和大小提升，千粒重显著提高。

在讨论部分，研究人员指出HaNAC84作为SNAC亚族成员，与多个已知的盐旱胁迫响应NAC转录因子具有序列相似性，其通过ROS清除、渗透调节、ABA介导的气孔调控等多条途径整合生长与胁迫响应。重要的是，与传统胁迫基因过表达常导致生长抑制不同，HaNAC84在增强抗逆性的同时促进了根系发育和光合效率，实现了抗逆与增产的双重效应。这一特性与水稻OsNAC5/10/68、豇豆VuNAC1/2等"双效"转录因子相呼应，但具体分子机制可能有所不同。

研究结论指出：HaNAC84通过调控ROS稳态、介导渗透调节、激活ABA合成与信号传导来赋予转基因植物盐旱耐受性，同时通过促进根系发育和增强光合作用来提高产量。这些发现为向日葵分子育种和盐碱地改良提供了基础理论依据和宝贵基因资源。未来工作将聚焦于阐明HaNAC84平衡产量与抗逆性的分子机制，以期应用于向日葵新品种培育。