靶向侵袭性肿瘤的铁死亡诱导剂R4VP化合物——降解RNF4与VHL双E3连接酶并引发选择性铁死亡

《Oncogene》：Discovery of ferroptosis-inducing R4VP compounds for targeting aggressive cancers

　　

摘要：侵袭性且治疗抵抗性肿瘤是临床治疗的重大挑战，与患者不良预后密切相关。鉴定可靶向这些肿瘤特定分子通路及其激活/抑制化合物，对改善患者结局至关重要。E3泛素连接酶RNF4通过稳定致癌蛋白及参与DNA修复促进肿瘤发生，且在癌、黑色素瘤及肉瘤中高表达并与不良预后相关。本研究设计开发了一类双E3连接酶靶向降解嵌合分子——R4VP（RNF4-VHL-Proteolysis Targeting Chimera-like Compounds），可同时招募RNF4与Von Hippel-Lindau蛋白（VHL）并促进二者蛋白酶体降解，进而降低RNF4所稳定的磷酸化致癌蛋白水平，同时清除VHL。R4VP选择性诱导癌细胞铁死亡（Ferroptosis），而不影响非致瘤细胞及原代细胞，其部分机制为共价结合并修饰抗铁死亡硒蛋白GPX4（Glutathione Peroxidase 4）。R4VP诱导的铁死亡优先杀伤携带表皮生长因子受体（EGFR）通路激活突变的细胞，对PI3K转化细胞无影响。因此，R4VP可有效杀死受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKi）耐药黑色素瘤及原代患者来源肉瘤细胞。本发现凸显了选择性铁死亡诱导剂（如R4VP）作为难治愈肿瘤治疗策略的潜力。

论文解读：Discovery of ferroptosis-inducing R4VP compounds for targeting aggressive cancers

本文发表于《Oncogene》。

一、研究背景与立题依据

侵袭性、晚期及治疗抵抗性肿瘤对常规化疗、受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKI）及免疫检查点抑制剂（ICI）响应率低，其关键特征为致癌蛋白异常稳定及肿瘤"成瘾"于特定生存信号。E3泛素连接酶RNF4（RING finger protein 4）属SUMO靶向泛素连接酶（STUbL），可通过催化异型K11/K33连接多聚泛素链稳定磷酸化致癌转录因子（如p^Ser62-c-Myc、p^Ser45-β-catenin），促进肿瘤发生、DNA损伤修复及血管生成；RNF4在多种癌、黑色素瘤及肉瘤中高表达，与不良预后正相关，且RTKi耐药黑色素瘤细胞对RNF4存在"成瘾"性依赖。传统小分子难以抑制RING结构域E3酶活性，而靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）技术可通过PROTAC（Proteolysis-Targeting Chimera）诱导靶蛋白蛋白酶体清除。此外，铁死亡（Ferroptosis）——一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡——为杀伤难治性肿瘤提供了新思路。本研究旨在设计并验证一类新型双E3连接酶降解分子R4VP（RNF4-VHL-Proteolysis Targeting Chimera-like Compounds），通过共降解RNF4与VHL并修饰抗铁死亡硒蛋白GPX4，选择性诱导侵袭性癌细胞铁死亡。

二、主要关键技术方法

研究人员以已知RNF4共价结合片段CCW16（L1）为起点进行衍生筛选获得高亲和力RNF4结合模块（R4B, R4BL3），将其经优化Linker偶联至VHL招募配体（VHL-recruiter, VHL-r）构建系列R4VP分子（含R4VPL3-1等）；设缺失共价氯原子的失活对照R4VPL3-1^chloro及替换VHL-r为生物素的阴性对照Biotin-R4VPL3-1。采用5-TAMRA-碘乙酰胺位移实验及生物素标记pull-down验证R4VP与RNF4 Cys⁵¹/Cys⁹¹共价结合。使用小鼠黑色素瘤B16F10、人PLX4032（Vemurafenib类似物）耐药黑色素瘤A375R、人鳞状细胞癌SCC1、永生化角质形成细胞HaCaT、原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、BEAS-2B肺上皮（分别转导BRAF^V600E、EGFR^L858R、PIK3CA^H1047R）、人骨肉瘤143B及手术获取的原代患者来源肉瘤细胞为模型。通过Western Blot检测RNF4、VHL、p-c-Myc、p-β-catenin、GPX4、NRF2、Keap1及剪切PARP蛋白水平；CCK-8/CellTiter-Glo检测细胞活力；软琼脂集落形成实验（Sphere Formation Assay, SFA）评估克隆形成；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析细胞死亡模式；C11-BODIPY 581/591荧光探针及4-HNE（4-Hydroxynonenal）免疫荧光检测脂质过氧化；RNA-seq比较R4VPL3-1与VHL-r处理A375R细胞的差异表达基因（DEG）并行KEGG及IPA通路富集；CRISPR/Cas9设计sgRNA敲除RNF4与VHL；过表达RNF4^C51A;C91A（RNF4^DM）双突变体验证结合特异性。患者来源肉瘤细胞经伦理委员会批准（#RBM-0536-22）并获知情同意。

三、研究结果

（一）R4VP-mediated proteasomal degradation of RNF4

R4VP（初代R4VP及优化后R4VPL3-1）处理B16F10及A375R细胞后，内源性RNF4及RNF4所稳定的p^Ser62-c-Myc、p^Ser45-β-catenin呈剂量和时间依赖性下降，可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断；同时R4VPL3-1也诱导VHL自身降解，证实R4VP通过招募E3连接酶促使RNF4与VHL双靶点进入蛋白酶体途径降解。

（二）Anti-cancer activities of RVP

R4VPL3-1（而非单独VHL-r或缺失氯原子失活类似物）显著抑制A375R（RTKi耐药黑色素瘤）及SCC1细胞增殖与集落形成，对非致瘤HaCaT角质形成细胞及原代MEF无明显影响；HaCaT中RNF4低表达且R4VPL3-1不引起RNF4/VHL及下游致癌蛋白降解，提示肿瘤选择性。

（三）Induced protein degradation and anti-cancer activity of R4VPL3-1

R4VPL3-1对A375R及SCC1的IC₅₀约0.3 μM；在HaCaT中不改变RNF4/VHL/p-c-Myc/p-β-catenin水平且无毒性，确认优化分子保留癌症选择性杀伤活性。

（四）R4VPL3-1 induced rapid cell death of RTKi-resistant melanoma cells

Annexin V/PI流式检测显示R4VPL3-1处理A375R后短时间内>50%细胞死亡；生物素-R4VPL3-1 pull-down证实野生型RNF4（HA-RNF4）结合而双突变RNF4^C51A;C91A（RNF4^DM）不结合，GST融合蛋白实验一致；过表达RNF4^DM不能挽救R4VPL3-1诱导死亡，说明致死效应严格依赖R4VP与RNF4 Cys⁵¹/Cys⁹¹共价作用及RNF4降解。

（五）R4VPL3-1 induces ferroptosis in cancer cells

RNA-seq显示R4VPL3-1处理A375R后差异基因显著富集铁死亡及坏死性凋亡通路签名；R4VPL3-1诱导4-HNE累积及C11-BODIPY氧化态绿色荧光偏移（脂质过氧化），被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Ferr-1）完全阻断；细胞死亡可被Ferr-1或铁螯合剂Deferasirox（DFX）抑制，不被泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK、自噬抑制剂氯喹（Chloroquine, Cq）或坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1s阻断；R4VPL3-1不引起PARP剪切（无凋亡特征），确证死亡方式为铁死亡而非凋亡/坏死性凋亡/自噬。

（六）The anti-ferroptotic selanoprotein GPX4 is targeted by R4VP3L-1

R4VPL3-1处理后GPX4蛋白出现电泳滞缓（slower migrating form）且总量上升（NRF2上调反代偿），该修饰仅见于含共价氯原子的活性R4VPL3-1；免疫沉淀显示VHL及GPX4可被R4VPL3-1（非R4VPL3-1^chloro）共沉淀，提示R4VP共价修饰GPX4使其功能失活；RSL3（经典GPX4抑制剂）与R4VPL3-1同样诱导A375R铁死亡且均不杀伤HaCaT，表明R4VP通过共降解RNF4/VHL及共价失活GPX4突破铁死亡防御。

（七）Molecular determinant for R4VPL3-1 selectivity

单独RNF4结合片段（R4B）无选择性杀伤正常与癌细胞，而完整R4VPL3-1具癌症选择性；替换VHL-r为生物素或Cereblon招募配体则失活，说明VHL模块对选择性及活性必需。BEAS-2B转化模型显示R4VPL3-1杀伤BRAF^V600E与EGFR^L858R驱动细胞，不杀伤PI3K^H1047R转化细胞（PI3K-mTOR-SREBP通路上调MUFA抑制铁死亡），说明敏感性取决于致癌驱动背景下的铁死亡易感性。

（八）Testing of R4VPL3-1 anti-cancer activity in patient-derived primary sarcoma cells

人骨肉瘤143B及多位原代未治疗患者来源肉瘤（多亚型，含未分化多形性肉瘤UPS）对R4VPL3-1敏感，IC₅₀≈0.5 μM，显著抑制原代肉瘤细胞增殖与集落形成，印证R4VP对RNF4高表达侵袭性实体瘤的治疗潜力。

四、讨论与结论翻译

研究人员开发了命名为R4VP的铁死亡诱导分子，可清除RNF4及其稳定化的磷酸化致癌蛋白、E3连接酶VHL及共价修饰抗铁死亡硒蛋白GPX4，选择性诱导侵袭性癌细胞（RTKi耐药黑色素瘤、原代肉瘤、EGFR/BRAF突变肺癌）发生铁死亡，不影响非致瘤细胞。R4VP通过共价结合RNF4非RING域Cys⁵¹/Cys⁹¹介导RNF4-VHL双降解，区别于经典PROTAC且仅VHL-recruiter可赋予选择性；其致死机制要求共消除RNF4、VHL及失活GPX4三重协同作用。敏感性受致癌驱动背景调控（EGFR/BRAF突变敏感，PI3K突变抵抗）。R4VP代表一类具肿瘤选择性的新型铁死亡诱导剂（Ferroptosis Inducer, FIN），为难治性肉瘤及RTKi耐药黑色素瘤提供了候选治疗策略。