ABA/JA激活的bHLH转录因子PalBH1参与狼尾草（Pennisetum alopecuroides）耐寒性调控

《Polar Science》：ABA/JA activated bHLH transcription factor PalBH1 is involved in cold tolerance in Pennisetum alopecuroides

　　

低温胁迫可通过诱导氧化损伤和光合作用抑制而严重限制植物生长。尽管碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）转录因子已被证实参与逆境应答，但其在狼尾草（Pennisetum）低温适应中的作用仍不明确。研究人员鉴定到一个耐寒种质——狼尾草品种“Liqiu”（LQ）。转录组测序与加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）共同锁定了PaIBH1（P. alopecuroides ILI1 BINDING bHLH），该基因为受低温诱导的bHLH转录因子核心枢纽基因。PaIBH1在拟南芥中的异源过表达提高了植株耐寒性，其表现为光合作用更稳定、膜完整性得以维持、抗氧化能力增强，且未以牺牲植物生长为代价，这一性状组合具有重要农艺学意义。其启动子含有脱落酸（abscisic acid, ABA）和茉莉酸（jasmonate, JA）响应元件，且两种激素在低温胁迫下均发生积累。抑制ABA或JA生物合成会抑制PaIBH1表达并提高冷敏感性。荧光素酶报告实验进一步表明，PaIBH1可在转录水平上激活PaNAC019和PaHAI2。PaIBH1通过调控胁迫响应过程并上调参与胁迫应答和活性氧（reactive oxygen species, ROS）清除的下游基因，协调植物抗寒性。该研究揭示了由ABA和JA信号激活的PaIBH1可增强狼尾草低温适应性，并为改良牧草耐寒性提供了遗传资源。

该论文发表于《Polar Science》，聚焦多年生牧草狼尾草低温适应的分子调控机制。研究背景在于，狼尾草属植物是饲草生产与生态修复的重要资源，但许多高生物量青贮型材料天然耐寒性不足，限制了其在北方温带和高海拔地区的推广。既有研究主要集中于渗透调节、抗氧化防御和地下器官结构等生理层面，而对低温耐受分子网络的认识仍较有限。虽然CBF（C-repeat binding factor）相关通路已被证明在冷响应中居于核心地位，但狼尾草中关键调控基因仍然匮乏，尤其是非经典bHLH家族成员在耐寒中的作用尚未得到清晰界定。因此，发掘本土种质中的耐寒核心基因、解析其调控网络并服务于分子育种，具有明确的理论意义和应用价值。

围绕这一问题，研究人员首先对10份狼尾草地方种质进行系统耐寒筛选，通过表型、生长参数、叶绿素荧光及气体交换指标综合判定，筛选出耐寒性最强的材料LQ。随后，对LQ在不同低温梯度下开展转录组测序，并结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定冷响应核心枢纽基因，最终锁定PaIBH1。进一步通过亚细胞定位、表达模式分析、拟南芥异源过表达、抗氧化与渗透调节指标测定、激素含量检测、抑制剂干预以及双荧光素酶实验，系统解析PaIBH1在低温胁迫中的功能及其上下游调控关系。研究得出结论：PaIBH1是一个受ABA与JA共同激活的IBH1型bHLH转录因子，可通过维持光合系统稳定、增强ROS清除能力、促进渗透保护物质积累，并激活PaNAC019和PaHAI2等下游胁迫响应基因，从而显著提高低温耐受性。尤其重要的是，PaIBH1带来的耐寒增益并未伴随明显的生长抑制，这使其具有较高的育种利用潜力。

主要技术方法方面，研究人员以北京市小汤山国家精准农业研究示范基地获得的10份狼尾草种质为材料，进行分级低温处理及生理表型评价；以耐寒材料LQ为对象开展不同温度梯度转录组测序，并通过WGCNA筛选关键模块和枢纽基因；构建PaIBH1过表达载体并转化拟南芥进行异源功能验证；结合qRT-PCR、DAB/NBT组织化学染色、抗氧化酶活性测定、ABA/JA含量测定和激素抑制剂处理分析其调控机制；最后采用烟草瞬时表达双荧光素酶报告体系验证PaIBH1对候选下游基因启动子的转录激活作用。

3.1. Physiological and morphological evaluation of cold tolerance in native P. alopecuroides germplasms
研究人员对10份狼尾草地方种质进行0℃、?5℃和?10℃低温处理，发现所有材料均出现不同程度叶片卷曲和生长受抑，但LQ受害最轻，Dongfang（DF）最重。随着温度降低，叶长、叶宽、株高、叶面积和鲜重显著下降，萎蔫率显著上升。LQ在各项生长指标上均表现最佳，其0℃和?5℃下萎蔫率显著低于DF。叶绿素荧光和气体交换分析表明，LQ与Changsui在Fv/Fm、Fv/Fo、ETo/CSm、Pn、Gs和Tr等指标下降幅度较小，Ci升高较少，提示其光系统受损较轻、光能利用效率更高。相关性分析、主成分分析和隶属函数综合评价共同确认LQ为耐寒性最强材料，为后续分子研究提供了理想对象。

3.2. Transcriptome analysis of P. alopecuroides in response to cold stress
针对LQ，研究人员在22℃、10℃、5℃、0℃、?5℃和?10℃条件下开展叶片转录组分析。测序数据质量较高，样品重复性良好。差异表达分析显示，不同温度处理均引发大规模转录重编程，并存在548个共同响应差异表达基因。GO（Gene Ontology）富集结果表明，这些差异基因主要涉及氧化还原酶活性、催化活性、转移酶活性、激酶活性、叶绿体功能、蛋白修饰与磷酸化、碳水化合物代谢以及质外体相关过程，提示低温响应同时涉及光合作用调控、氧化胁迫防御和代谢重塑。

3.3. WGCNA analysis
研究人员进一步对差异表达基因进行WGCNA，构建共表达网络并识别与不同低温阶段最相关的模块。其中，turquoise、green和dark turquoise模块分别与10℃、5℃和?10℃处理高度相关。功能富集显示，这些模块涉及刺激响应、生物调控及催化活性等过程。通过模块内连接度和cytoHubba算法筛选枢纽基因后，PaIBH1在turquoise模块中显示最高连接度，被界定为早期冷响应中的核心调控节点，因此成为重点功能研究对象。

3.4. Molecular characterization and evolutionary analysis of PaIBH1
PaIBH1基因含2个外显子和1个内含子，编码195个氨基酸。蛋白质结构预测显示其主要由α螺旋和无规卷曲组成。系统发育分析表明，PaIBH1与狗尾草和Panicum hallii中的同源蛋白亲缘关系最近，属于IBH1亚家族，与ICE1/ICE2所在的经典冷信号分支明显分离。序列比对提示其保留HLH二聚化结构域，但缺乏典型bHLH成员具有的basic DNA结合区，说明其更可能通过蛋白互作而非经典直接DNA识别发挥作用。亚细胞定位结果表明PaIBH1定位于细胞核。GUS染色显示该基因在根、茎和莲座叶中广泛表达。低温下，PaIBH1在LQ根、茎、叶中均被显著诱导，在不同组织达到不同峰值；且在耐寒材料LQ和CAS中的诱导水平明显高于其他材料。PaIBH1表达量与叶宽、叶面积、Fv/Fm和Tr显著正相关，与萎蔫率显著负相关，支持其与耐寒表型密切关联。

3.5. Overexpression of PaIBH1 enhances cold tolerance of Arabidopsis
为验证功能，研究人员构建PaIBH1过表达拟南芥株系OE-24和OE-28。低温处理后，转基因植株萎蔫程度明显低于野生型（WT），形态保持更好。生理指标显示，过表达株系鲜重显著提高，萎蔫率显著下降，相对电导率降低，说明膜稳定性增强；叶绿素含量增加，Fv/Fm、PI_abs和PI_total显著升高，OJIP曲线受损程度更轻，说明PaIBH1有助于维持光合机构功能与膜系统完整性，从而提升低温存活和恢复能力。

3.6. PaIBH1 regulates antioxidant capacity and osmotic protection in response to cold stress
DAB和NBT染色表明，在正常条件下WT与过表达株系ROS水平相近，但在?5℃处理2–6 h后，WT中H₂O₂和O₂^•?积累更为明显，而过表达材料染色较浅。定量检测证实，转基因植株H₂O₂和O₂^•?含量降低，MDA（malondialdehyde，丙二醛）水平下降，表明脂质过氧化和膜氧化伤害减轻。同时，POD（peroxidase）、SOD（superoxide dismutase）和CAT（catalase）活性在转基因株系中更高，脯氨酸和可溶性糖等渗透保护物质积累也更强。结果说明PaIBH1通过增强抗氧化体系和渗透调节体系，缓解低温诱导的氧化损伤。

3.7. Transcriptome profiling reveals that PaIBH1 enhances cold tolerance by modulating the expression of ROS-scavenging genes
在拟南芥中过表达PaIBH1后，低温时间序列转录组分析显示，OE-24和OE-28分别产生大量差异表达基因，且以上调基因为主。研究人员进一步筛选出两个过表达株系共有的65个核心差异基因。GO富集表明，这些基因集中于刺激响应、非生物胁迫响应和应激反应。其中特别值得关注的是NAC019、SWEET13、HAI2和PYL6等基因在过表达背景下受到更强诱导。结合这些基因已知的抗逆与ROS清除功能，研究指出PaIBH1可能通过激活一组应激响应基因，构建促进ROS清除的下游转录网络。

3.8. ABA and JA coordinately activate PaIBH1 transcription to enhance cold stress tolerance in P. alopecuroides
PaIBH1启动子分析发现其含有ABRE和CGTCA-motif等ABA、JA响应顺式元件，也包含DRE core、LTR、W box和MYB识别位点等环境胁迫响应元件。低温处理过程中，LQ内源ABA和JA含量均显著升高，分别在4 h和6 h达到峰值。采用ABA生物合成抑制剂FLU和JA生物合成抑制剂DIECA处理后，植株在冷胁迫下鲜重下降、萎蔫率升高，表现出更强冷敏感性；同时PaIBH1的冷诱导表达被明显抑制。由此可见，PaIBH1是ABA和JA信号汇聚的转录响应节点，其冷诱导表达依赖这两条激素通路的共同激活。

3.9. ABA and JA enhance cold tolerance through the PaIBH1-mediated ROS scavenging pathway in P. alopecuroides
为进一步验证ABA和JA是否通过PaIBH1介导ROS清除来增强耐寒性，研究人员向LQ外施ABA、JA或相应抑制剂后再进行低温处理。结果表明，正常温度下不同处理间ROS染色差异不显著；而在?5℃下，ABA或JA处理可明显减弱DAB/NBT染色，并降低H₂O₂、O₂^•?及MDA积累；FLU和DIECA则导致染色加深与氧化伤害加剧。这说明ABA和JA可通过诱导PaIBH1及其相关抗氧化防御途径，限制低温条件下ROS过量积累。

3.10. PaIBH1 enhances the transcriptional activity of PaNAC019 and PaHAI2 promoters
结合过表达转录组和狼尾草同源基因表达分析，研究人员选择PaNAC019、PaSWEET13、PaHAI2和PaPYL6作为候选下游基因。qRT-PCR显示，这些基因在低温下均可上调，且受ABA和JA正调控。进一步双荧光素酶实验表明，PaIBH1可显著增强PaNAC019和PaHAI2启动子的活性，但对PaPYL6和PaSWEET13启动子无显著激活作用。因此，PaNAC019和PaHAI2被鉴定为PaIBH1功能下游的关键候选效应基因，提示存在“ABA/JA—PaIBH1—PaNAC019/PaHAI2—ROS清除/胁迫应答”的调控链条。

讨论部分总结
论文讨论部分首先强调，本研究的一个突出特点在于将生理筛选、转录组学与WGCNA顺序整合，从群体表型到核心枢纽基因实现了多层级递进筛选，使PaIBH1不仅被视为差异表达基因，而且被定位为冷响应网络中的潜在主调控因子。其次，作者指出PaIBH1属于非典型IBH1型bHLH蛋白，与ICE1/ICE2类经典冷信号因子在系统发育位置和结构特征上均明显不同，尤其缺失典型basic DNA结合域，提示其可能主要依赖蛋白互作而非经典DNA结合方式介导转录调控。进一步，讨论部分概括了PaIBH1在生理层面的多重保护作用：稳定PSII（photosystem II，光系统II）功能，减轻光抑制；降低电解质渗漏和MDA积累，维护膜系统完整性；提升SOD、POD、CAT活性以及脯氨酸和可溶性糖积累，强化抗氧化与渗透调节防线。转录组结果则支持PaIBH1通过重塑下游应激基因表达网络参与ROS稳态维持。上游调控方面，启动子元件分析、激素积累和抑制剂实验共同表明，ABA与JA信号在PaIBH1启动子处发生汇聚，从而触发冷适应程序。最后，作者结合双荧光素酶结果提出PaNAC019和PaHAI2是PaIBH1的重要下游响应因子，但同时指出目前尚不能据此证明PaIBH1对其实施直接结合型转录激活，后续仍需通过EMSA、Y1H、ChIP-qPCR、Co-IP或BiFC等实验完善机制链条。此外，研究也坦诚其功能验证主要依赖异源系统，尚缺乏狼尾草自身遗传转化或敲除材料的原位证据。

研究结论翻译
总之，该研究从生理性状出发，逐步建立了一个较完整的调控模型。研究人员鉴定出PaIBH1是低温胁迫下由ABA和JA信号汇聚激活的关键调控节点。随后，PaIBH1作为胁迫响应调节因子，通过同时稳定光合作用、激活广泛的抗氧化与渗透保护系统，并可能调节专门参与ROS清除的下游转录网络，从而增强植物耐寒性。值得注意的是，PaIBH1过表达带来的耐寒性提升并未伴随生长代价，这一点使其区别于经典IBH1同源因子，并成为作物改良中尤具吸引力的靶基因。双荧光素酶报告实验进一步揭示，PaIBH1可功能性激活PaNAC019和PaHAI2启动子，确定了这两个基因为候选下游效应因子。该研究不仅加深了对狼尾草耐寒分子基础的理解，也将PaIBH1定位为牧草及其他作物耐寒分子育种的重要遗传资源。与此同时，研究结论也指出，本研究的功能评价主要在异源系统中完成，PaIBH1在狼尾草中的功能仍需进一步验证；此外，LUC实验仅证明了PaIBH1与PaNAC019/PaHAI2启动子之间存在功能关联，尚不足以确认其为直接转录激活因子。未来研究应优先推进两个方向：其一，在狼尾草中开展稳定遗传转化以验证PaIBH1功能；其二，结合EMSA、Y1H、ChIP-qPCR及Co-IP/BiFC等方法解析其靶基因调控机制，最终构建该物种低温适应的完整分子模型。