《Plant Stress》：CRISPR-tool box and its applications in tomato: From Stress Resilience to Trait Improvement
CRISPR-Cas基因组编辑已通过实现农业重要基因的精确、快速且低成本修饰，彻底改变了植物生物技术。早期应用主要集中于Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）所实现的基因破坏，而当前的基因组编辑技术谱系已扩展至同源定向修复（HDR）、碱基编辑（base editing）、先导编辑（prime editing）以及表观基因组调控（epigenome modulation）。这些技术进步促进了靶向等位基因替换、基因功能的精细调控以及调控元件的精准调节。下一代平台进一步应对了植物基因组工程中的持续性挑战，包括脱靶效应、编辑精度受限以及基因家族冗余等问题。
在番茄（Solanum lycopersicum）中，有限的遗传多样性制约了传统育种的效果，因此凸显出精准基因组工程的必要性。近期研究进展已将番茄确立为CRISPR-Cas基因组编辑的重要模式体系，这主要归因于其基因组注释完善、世代周期短以及遗传资源丰富。不断扩展的基因编辑工具集使研究人员能够对控制关键农艺性状的基因进行靶向修饰，这些性状包括果实发育、成熟、营养成分、株型以及生物与非生物胁迫抗性。多样化的Cas变体与编辑平台的可用性支持定制化基因组工程策略，以应对多基因性状调控和基因家族冗余等复杂挑战。本文综述了CRISPR技术、番茄转化与递送方法的最新进展，以及其在改良植株表型、果实品质和胁迫耐受性方面的应用。
1. Introduction
本文首先概述了CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系统在基因组工程领域中的革命性意义。文章指出，CRISPR最初来源于细菌和古菌的适应性免疫系统，其核心机制是依赖RNA引导的核酸酶识别并切割外源核酸。自2012年研究人员证实CRISPR-Cas9可在真核细胞中介导基因组编辑以来，该技术逐步从简单的DNA双链断裂诱导工具，发展为涵盖碱基编辑、先导编辑、RNA靶向编辑和表观调控的综合技术体系。文中强调，失活Cas蛋白（dCas）融合转录或表观修饰效应器后，可通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控回路实现基因表达的精细调控。
在作物背景下，文章将番茄界定为全球重要蔬菜作物及果实生物学研究模式植物。番茄富含番茄红素、维生素和膳食纤维，但生产中长期受到病原侵染、干旱、盐胁迫和极端温度等因素制约。传统育种因世代周期长、多基因控制和栽培种遗传多样性狭窄而效率受限，因此需要借助CRISPR实现对胁迫响应基因、启动子和调控网络的精准操控。本文据此提出，CRISPR技术与转录组学、非编码RNA调控网络以及基因组选择相结合，可为番茄精准育种提供系统性解决方案。
2. Literature Search Strategy and Scope
本节说明了综述的文献检索策略与范围。研究人员主要从Web of Science、Scopus和PubMed等数据库收集文献，检索词覆盖“CRISPR”“Cas9”“Cas12”“Cas13”“tomato”“Solanum lycopersicum”“genome editing”“base editing”“prime editing”“stress tolerance”等。纳入文献以2012年至2026年的同行评议论文为主，重点关注近5至7年的技术进展，同时保留奠基性研究。文献筛选以CRISPR工具开发、优化、递送系统及其在番茄中的应用为核心，尤其关注具有实验验证、涉及抗逆性、果实品质和植株结构改良的研究。整体结构围绕CRISPR系统类型、编辑机制、递送方式和番茄性状应用展开。
3. The Past: Development and Historical Background of CRISPR Genome Editing
文章回顾了基因组编辑技术的发展脉络。早期定点编辑概念建立于DNA修复研究基础之上，I-SceI诱导的DNA双链断裂（DSB）被证明可提高真核细胞中的同源重组效率。随后，锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）相继问世，但因设计与构建复杂，其应用受到限制。
CRISPR-Cas系统的出现带来了范式转变。文章从1987年E. coli中CRISPR重复序列的发现讲起，追溯至2000年代对cas基因和间隔序列来源的认识，最终引出其作为原核生物适应性免疫系统的理论建立与实验验证。该部分说明，CRISPR技术的发展并非孤立事件，而是经历了从基础生物学发现到可编程基因编辑平台建立的连续演进过程，这为其在植物中的广泛应用奠定了理论与方法基础。
4. CRISPR-Cas System Classification
本节系统介绍了CRISPR-Cas系统的分类框架。依据Cas蛋白组成、效应复合体结构及pre-crRNA加工与干扰机制的差异，CRISPR-Cas系统被划分为2个类别、6种类型和33种亚型。Class 1系统包括I、III和IV型，依赖多亚基效应复合体；Class 2系统包括II、V和VI型，主要依赖单一大型效应蛋白，如Cas9、Cas12和Cas13。文章特别指出，VI型系统靶向RNA而非DNA，体现出CRISPR功能层面的多样性。该分类框架不仅有助于理解CRISPR系统的进化来源，也为不同编辑目的选择合适的Cas工具提供了理论依据。
5. CRISPR-Cas system and its molecular mechanism of genome editing
文章将CRISPR-Cas分为适应（adaptation）、表达与成熟（expression and maturation）、干扰（interference）三个阶段。适应阶段中，外源核酸片段被整合为新的spacer，构建免疫记忆；表达阶段中，CRISPR阵列转录为前体CRISPR RNA（pre-crRNA），并在tracrRNA和RNase III作用下加工为成熟crRNA；干扰阶段中，crRNA-tracrRNA复合体引导Cas核酸酶识别邻近PAM的靶DNA并切割。
针对应用最广泛的SpCas9，文中介绍其由识别叶（REC）和核酸酶叶（NUC）构成，HNH与RuvC结构域分别切割DNA双链的不同链。sgRNA与Cas9结合后触发构象变化，使切割位点定位于PAM上游3个核苷酸处。DSB形成后，主要通过经典非同源末端连接（cNHEJ）修复，产生插入/缺失（indel）；而同源定向修复（HDR）则可实现精确编辑，但受细胞周期和染色质可及性限制。文章还指出，通过抑制Ku、过表达RAD51或调控染色质状态，可促进HDR或微同源介导末端连接（MMEJ），从而提高编辑精度。
6. CRISPR-Cas Systems: Emerging Tools Beyond Cas9
本文强调CRISPR工具箱已显著超越Cas9。Cas3适用于大片段、kb级缺失的构建，可用于解析基因簇和调控区；Cas12（Cpf1）识别富含AT的PAM，产生黏性末端DSB，并可自行加工crRNA，适合多重编辑；Cas12b具有较小分子量和热稳定性，对植物工程具有潜力。Cas12还具有附带单链DNA切割活性，因此也被用于DETECTR等分子诊断平台。
Cas13则靶向单链RNA（ssRNA），可用于RNA沉默、RNA编辑与SHERLOCK诊断，支持高灵敏、单核苷酸分辨率的病原检测。Cas14是一类超小型单链DNA（ssDNA）靶向效应蛋白，对PAM依赖较弱，适合用于SNP检测和病原监测。该部分表明，不同Cas系统在靶分子类型、PAM要求、切割形式和递送难度方面各具特点，显著拓展了番茄基因组与转录组工程的工具选择空间。
7. Base and Prime editing and molecular mechanism
7.1. Base Editors
碱基编辑可在不产生DSB的条件下实现可预测的单碱基替换。DNA碱基编辑器分为胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。CBE通过胞嘧啶脱氨酶与Cas蛋白融合，将C•G转换为T•A；ABE则通过腺苷脱氨酶介导A→I转变，复制后表现为A•T到G•C转换。文章还提到RNA碱基编辑依赖ADAR等酶实现A-to-I或C-to-U转换，并结合Cas13实现可编程转录本修饰。
7.2. Prime Editors
先导编辑（PE）由Cas9切口酶、逆转录酶（RT）和先导编辑向导RNA（pegRNA）组成，可在无DSB和无供体DNA条件下实现全部12种碱基替换以及小片段插入/缺失。其机制是通过单链切口后使3′DNA flap与pegRNA中的引物结合位点（PBS）退火，再由RT将预设编辑写入基因组。文中强调，PAM兼容性扩展型Cas9变体以及PBS长度、RTT长度和GC含量优化，是提高PE效率的关键。
7.3.-7.7. 表观与转录调控模块
除序列编辑外，文章总结了dCas融合DNA甲基转移酶（DNMT）、TET去甲基化酶、转录激活/抑制结构域、组蛋白乙酰化酶（HAT）、去乙酰化酶（HDAC）、组蛋白甲基转移酶（HMT）和去甲基化酶等策略，用于位点特异性DNA甲基化、去甲基化、转录激活（CRISPRa）、转录抑制（CRISPRi）、组蛋白修饰和染色质重塑。利用带RNA适配体的sgRNA还可募集非编码RNA介导的效应因子，实现更复杂的转录与表观调控网络构建。
8. gRNA Design, Cloning, and Delivery in Plants
本节聚焦植物中CRISPR实验设计与递送策略。sgRNA特异性不仅取决于20-nt spacer序列，还受GC含量、二级结构、染色质状态和转录起始位点邻近性影响。CRISPRdirect、CHOPCHOP、CRISPR-Plant、CRISPOR等生物信息学工具可用于sgRNA设计和脱靶预测。
在构建策略上，Golden Gate组装、PCR/Gibson克隆、tRNA介导多重编辑、ribozyme/Csy4加工及无DNA合成sgRNA均可支持模块化编辑。递送方式方面，农杆菌介导转化仍是植物中最成熟方案，具有效率高、拷贝数低、适于稳定整合等优势；原生质体中Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP）递送可避免外源DNA整合，但受限于再生能力；病毒诱导基因组编辑（VIGE）利用TRV或PVX系统可在Cas9表达背景下快速、系统性递送sgRNA，支持无组织培养或低组织培养条件下的可遗传编辑。总体上，这些策略共同构成番茄功能基因组学与精准育种的重要技术支撑。
9. Applications of CRISPR-Cas9 in Tomato Improvement
9.1. Genome Editing Events in Tomato: Beyond Cas9
该部分系统概述了番茄中超越常规Cas9敲除的多类应用。碱基编辑方面，早期CBE已在ALS等位点实现高效C-to-T编辑并获得除草剂抗性；Target-AID系统则在SlDELLA、SlETR1和SlETR2等位点实现可遗传、无转基因点突变，支持激素响应调控。后续研究进一步利用该平台编辑类胡萝卜素通路相关基因，如SlDDB1、SlDET1和SlCYC-B，以实现数量性状调控。更先进的C-to-G碱基编辑器进一步扩大了可编辑碱基转换类型。
先导编辑在番茄中的应用虽受效率制约，但通过pegRNA优化、复合启动子和病毒复制子系统增强后，已实现更高频率的精准编辑。值得注意的是，先导编辑还被用于启动子顺式调控元件的精准插入，例如向细胞壁转化酶（CWIN）启动子中插入10-bp热激元件，从而在热胁迫条件下提升同化物分配和产量。
在无DNA编辑方面，RNP递送可在SP和SP5G等位点获得无转基因突变体；VIGE技术则利用TRV或PVX高效传递sgRNA，在叶片、果实甚至后代中实现可遗传编辑。除基因组改造外，Cas13系统还被用于番茄病原检测，CRISPRa则可通过激活SlWRKY29等基因促进体细胞胚发生，显示出CRISPR在诊断和发育调控方面的扩展应用。
9.2. Abiotic Stress Mitigation
文章总结了CRISPR在番茄非生物胁迫抗性改良中的多层次应用。首先，通过编辑负调控因子实现抗逆增强，例如SlHyPRP1不同结构域的定向突变分别提高盐胁迫和热胁迫耐受性；SlABIG1和SlLBD40敲除增强盐和干旱适应性。其次，CRISPR揭示了氧化还原稳态在胁迫响应中的关键作用，如SlGRXS14/15/16/17在胚胎发生、开花和多重胁迫中的非冗余功能，SlNPR1、CPK28和SlMAPK3则分别关联气孔调控、ROS稳态、APX活性与热/冷胁迫响应。
激素调控层面，SlARF2、SlARF4和SlMYC相关突变揭示了生长素（auxin）、脱落酸（ABA）与茉莉酸（JA）之间的协同作用。离子稳态方面，SlHAK20、SlSOS1和SlHKT1;2的编辑或等位变体优化直接关系K
+/Na
+平衡和盐胁迫适应。整体而言，这些研究表明CRISPR不仅可用于验证胁迫调控网络中的关键节点，还可直接产出具有改良表型的番茄材料。
9.3. Biotic Stress mitigation
在生物胁迫方面，CRISPR主要用于 susceptibility gene（S基因）与免疫负调控因子的功能解析和定向改造。文中指出，SlPelo编辑可显著降低番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）积累，SlMlo1敲除赋予白粉病抗性，SlDMR6-1失活则提高对细菌、卵菌和真菌的广谱抗性，且生长代价较小。其他负调控因子如SlHyPRP1、SlDEA1、PUB21和DND1的编辑也有助于增强细菌性病害或坏死营养型真菌抗性。
此外，CRISPR不局限于敲除策略。dCas12a介导的转录激活可上调SlPAL2以增强细菌性溃疡病抗性；对GAD2和SlSNAT2等代谢调控基因的编辑则揭示了γ-氨基丁酸（GABA）和褪黑素在防御中的作用。该部分说明，番茄抗病改良已从单一病原抗性转向免疫网络、代谢信号与宿主-病原互作机制的系统编辑。
9.4. Plant phenotype, flower, and fruit traits
本节是全文应用层面最丰富的部分，集中总结了CRISPR在株型、开花、雄性不育、单性结实、果实发育和营养品质方面的成果。株型方面，DWARF、SP、SP5G、WRKY-B、SlD14、TAC1-like等基因编辑可调控植株高度、分枝和冠层结构，适于高密度栽培和设施园艺。开花与生殖方面，SlFAF家族、FA及多个雄性不育相关基因的编辑，为杂交育种和花序结构优化提供了依据。
果实性状方面，研究覆盖果形、果重、心室数、成熟、软化、硬度、货架期、颜色和风味等多个维度。RIN、NOR、CNR、PL、PG2a、TAGL1等成熟相关基因的编辑揭示了果实成熟和后熟调控网络；MYB12、Psy1、CrtR-b2、SGR1、LCY-B等基因的改造可重塑番茄红素、β-胡萝卜素和花青素积累；GAD2/GAD3、GABA-TP、INVINH1、VPE5、APX4等基因则关联GABA、糖分、抗氧化物质和维生素等营养品质。
文章同时强调，CRISPR已从单基因功能验证推进到多基因并行编辑与代谢通路工程，能够同步改善产量、营养和抗逆性。随着RNA病毒介导递送、无转基因编辑和表观激活技术的发展，番茄性状设计正从“基因敲除”迈向“精准调控”和“理性创制”阶段。
10. Concluding Remarks and Future Directions
结论部分认为，CRISPR-Cas已成为番茄改良的基础性平台，在产量、果实品质、胁迫耐受性和株型设计方面展现出高度灵活性。核酸酶工程化、PAM兼容性扩展、高保真Cas变体、碱基编辑、先导编辑、多重编辑、表观基因组编辑以及RNP和VIGE等无转基因递送方式，共同推动了番茄精准育种能力的提升。
不过，文章指出实际应用仍受基因型依赖性转化效率的限制，尤其是在部分栽培种和野生近缘种中，体外再生能力不足和形态发生调控薄弱仍是瓶颈。为此，WUSCHEL（WUS）、BABY BOOM（BBM）和GRF-GIF等形态发生调控因子的引入，以及优化外植体类型和激素配比，被视为缓解转化障碍的关键方向。未来，高精度编辑平台与形态发生辅助再生体系的整合，有望实现复杂优良性状的快速聚合，并加速在栽培种与野生种质中的功能验证和育种转化。
