整合的转录组学和代谢组学分析揭示了AtGASA1和AtGASA4在拟南芥中与水杨酸途径相关的免疫反应中的作用

《Plant Science》：Integrated transcriptomic and metabolomic analyses reveal the involvement of AtGASA1 and AtGASA4 in salicylic acid pathway-associated immune responses in Arabidopsis

　　

Jian-Bo Song|Ya-Ru Li|Zi-Xin Zhao|Xian-Zhi Zuo|Cai-Feng Wang|Min Huang|Shu-Fan Liu|Yu-Fan Chen|Wen-Qian Song|Lin Wang|Ying-Juan Wang|Xuan Huang

教育部西部资源生物学与生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院生物技术省级重点实验室，中国陕西省西安市太白北路229号，邮编710069

摘要

赤霉素刺激的拟南芥（Arabidopsis）GASA基因家族编码一类富含半胱氨酸的蛋白质，这些蛋白质的特征是具有N端信号肽和保守的C端GASA结构域，该结构域包含12个半胱氨酸（Cys）残基。这些小分子植物特异性蛋白质已在多种物种中被发现，主要调节植物生长和非生物胁迫反应。然而，AtGASA家族成员是否也参与对细菌病原体的免疫反应仍很大程度上尚未被探索。在本研究中，我们发现gasa1和gasa4突变体比Col-0对P. syringae感染的敏感性增加。为了阐明这些基因在植物免疫中的作用，我们进行了转录组学和代谢组学分析。与Col-0相比，转录组分析在gasa1和gasa4突变体中鉴定出957个差异表达基因（DEGs），而代谢组分析则发现了900个差异积累的代谢物（DAMs）。综合转录组学和代谢组学分析进一步表明，DEGs和DAMs在关键途径中共同富集，包括植物激素信号传导和各种植物次生代谢物的生物合成。值得注意的是，在植物激素信号传导途径中，与水杨酸（SA）生物合成和信号传导相关的多个基因（包括ICS1、EDS1、PAD4、PR1和PR5）在突变体中表达不同。一致地，gasa1和gasa4突变体中的SA水平显著低于Col-0。这些发现共同表明AtGASA1和AtGASA4参与了P. syringae感染期间的SA途径相关免疫反应。

引言

植物免疫依赖于两个相互连接的防御层：模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI），它们共同保护植物免受病原体入侵（Meng等人，2013年；B?hm等人，2014年）。PTI作为第一道防线，当植物细胞表面的模式识别受体（PRRs）检测到病原体相关分子模式（PAMPs）时启动（Rao等人，2018年；Sun等人，2020年）。这种识别激活了下游信号传导，包括活性氧（ROS）的产生、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应以及防御相关基因的转录重编程，最终限制病原体的增殖（Lamb等人，1989年；Jones等人，2024年）。然而，适应性强的病原体可以通过将效应子蛋白传递到宿主细胞中来抑制PTI，从而激活ETI（Boller和Felix，2009年；Prautsch等人，2023年）。ETI是一种更强大的免疫反应，由细胞内核苷酸结合的富含亮氨酸重复序列（NLR）蛋白介导，这些蛋白能够识别特定的病原体效应子（Aarts等人，1998年）。这种识别通常会触发超敏反应（HR），这是一种局部形式的程序性细胞死亡，可以限制病原体的传播（Kourelis等人，2022年）。尽管PTI和ETI传统上被认为是独立的免疫途径，但新的证据表明它们作为一个连续体发挥作用，具有重叠的信号成分，形成了一个动态且整合的免疫网络（Zhang等人，2023年）。在植物抗性建立过程中，水杨酸（SA）作为一种核心信号分子，在拟南芥中介导局部和系统性的获得性抗性（SAR）。核心成分如异构焦磷酸合成酶1（ICS1）、增强疾病敏感性1（EDS1）和植保素缺乏4（PAD4）有助于SA的积累，而病原相关基因如PR1和PR5的诱导被广泛认为是SA依赖性防御反应的标志（Wang等人，2024年）。

赤霉素刺激的拟南芥（GASA）基因家族编码一组植物特异性多肽，其特征是具有保守的C端GASA结构域，该结构域包含12个不变的半胱氨酸残基（Bouteraa等人，2023年）。这些半胱氨酸残基对于维持蛋白质稳定性、调节氧化还原活性以及与其他蛋白质的相互作用至关重要（Ben-Nissan等人，2004年；Wigoda等人，2006年）。一项针对33种植物的综合研究鉴定了12,824个富含半胱氨酸的肽（CRP）基因，其中445个编码GASA蛋白，突显了这一家族的进化保守性和潜在的功能重要性（Silverstein等人，2007年）。GASA蛋白参与了多种生物过程，包括细胞伸长、开花、种子发育和激素信号传导（Ben-Nissan等人，2004年；Wang等人，2009年；Rubinovich和Weiss，2010年；Sun等人，2013年）。除了在植物生长中的作用外，越来越多的证据表明GASA蛋白还参与非生物胁迫反应，如干旱和盐度（Segura等人，1999年；Furukawa等人，2006年；Bouteraa等人，2023年）。据提出，GASA蛋白可以调节多种植物激素信号通路及其在胁迫反应中的相互作用，特别是涉及赤霉素（GAs）、SA、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）的通路（Bouteraa等人，2023年）。然而，尽管有证据表明某些GASA成员参与了生物胁迫反应，但它们如何参与植物免疫的分子机制仍很大程度上尚未被探索。

转录组学和代谢组学是研究植物对环境胁迫和病原体感染反应的强大方法（Chen等人，2021年；Wei等人，2023年）。使用RNA-seq进行转录组分析可以识别参与免疫反应的差异表达基因（DEGs）和关键调控通路（Tiwari等人，2022年；Tang等人，2023年）。然而，转录水平的变化并不总是转化为功能上的生化变化，因此代谢组学是一种重要的补充方法，用于捕捉动态的代谢重编程。代谢组分析可以识别与防御反应相关的差异积累的代谢物（DAMs），如植物激素SA和JA（Zhang等人，2021年）。整合转录组学和代谢组学可以从基因表达与代谢调节的角度提供更全面的植物免疫视角（Li等人，2024年；Ren等人，2023年）。因此，采用了多组学方法来进一步了解AtGASA1和AtGASA4在植物防御中的作用。

在这项研究中，我们旨在探讨AtGASA1和AtGASA4在拟南芥对P. syringae pv. maculicola ES4326（Psm ES4326）免疫中的作用。最初的结果显示，gasa1和gasa4突变体对Psm ES4326的抵抗力比Col-0弱。为了进一步探索分子机制，我们进行了转录组学和代谢组学分析，以确定gasa1和gasa4突变体与Col-0相比的关键DEGs和DAMs。整合组学分析表明，DEGs和DAMs在植物激素信号传导和次生代谢物生物合成等途径中共同富集。值得注意的是，在植物激素信号传导途径中，两个数据集一致表明AtGASA1和AtGASA4可能通过SA途径参与植物免疫反应。

章节片段

植物材料和生长条件

本研究中使用了野生型拟南芥Col?0、gasa1（SALK?001187.34.70.x）和gasa4（SALK_042431）突变体。这些突变体来自拟南芥生物资源中心（ABRC）。过表达植物是通过将< />构建体转化到Col?0中获得的，而互补线则是通过将相同的构建体引入gasa1或gasa4突变体背景中获得的。所有转化都是通过农杆菌完成的

gasa1和gasa4突变体对Psm ES4326感染的敏感性增加

先前的研究表明，GASA家族的几个成员参与了植物免疫调节。其中一些蛋白质可能作为抗菌肽直接影响病原体的存活（Berrocal-Lobo等人，2002年）。此外，我们之前的串联质量标签（TMT）标记的蛋白质组学分析显示，在Psm ES4326感染后，Col?0植物中的AtGASA1和AtGASA4蛋白水平显著增加（补充文件1）。值得注意的是，这两种蛋白质

讨论

GASA蛋白在植物物种间高度保守，在非生物和生物胁迫反应中发挥着关键作用（de la Fuente等人，2006年；Nahir?ak等人，2012年；Rodríguez-Decuadro等人，2018年）。在Canavalia rosea中，已经鉴定出23个GASA家族基因，而在酵母中异源表达特定的CrGASAs可以增强对H?O?、热胁迫和重金属毒性（Cd/Cu）的耐受性（Zhang等人，2022年）。同时，越来越多的证据表明GASA家族蛋白

结论

总之，综合转录组学和代谢组学分析表明，AtGASA1和AtGASA4参与了拟南芥中的SA途径相关免疫反应，可能作用于SA生物合成的上游，并伴随着关键SA相关基因（如ICS1、EDS1、PAD4、PR1和PR5）的表达改变以及突变体中SA积累的减少。此外，它们也可能通过维持ROS稳态参与植物免疫反应。然而，它们具体的作用机制

CRediT作者贡献声明

Cai-Feng Wang： 软件开发。Min Huang： 可视化。Xian-Zhi Zuo： 软件开发。Ya-Ru Li： 数据整理。Zi-Xin Zhao： 研究。Ying-Juan Wang： 方法学。Huang xuan： 写作——审稿与编辑，初稿撰写，概念构思。Jian-Bo Song： 初稿撰写。Wen-Qian Song： 形式分析。Lin Wang： 资源获取。Shu-Fan Liu： 方法学。Yu-Fan Chen： 软件开发。

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致谢

本研究得到了陕西省自然科学基金（2025JC-YBMS?241、2016JM3001）、国家自然科学基金（31300223）和国家大学生创新创业培训计划（202210697001）的资助。