格林-巴利综合征(Guillain–Barré syndrome, GBS)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的单细胞转录组(scRNA-seq)图谱分析

《Scientific Data》：Single cell transcriptome profiling of peripheral blood mononuclear cells in Guillain–Barré syndrome patients

　　

摘要：格林-巴利综合征（Guillain–Barré syndrome, GBS）是一种以急性外周神经脱髓鞘为特征、导致进行性肌无力和感觉丧失的自身免疫性疾病。尽管已知CD4+T细胞和循环单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophage)参与自身免疫性神经病，但循环免疫细胞的组成动态变化及活化机制仍不明确。本研究对3例GBS患者和2例健康对照者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），PBMC数据集经质量控制后共获得51,358个细胞。此外，研究人员利用小鼠模型单细胞数据集和大鼠转录组数据集验证了免疫细胞活化及招募情况。研究人员描绘了在炎性神经病中起致病枢纽作用的T细胞分化–趋化因子(chemokine)分泌轴。该数据资源为开发格林-巴利综合征的免疫调节疗法提供了不可或缺的基础。

格林-巴利综合征(GBS)患者外周血单个核细胞(PBMC)单细胞转录组图谱研究解读

本文发表于《Scientific Data》。格林-巴利综合征（Guillain–Barré syndrome, GBS）是最常见的急性弛缓性瘫痪原因，其两个主要亚型为急性炎性脱髓inating性多发性神经病（acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP）和急性运动轴索型神经病（acute motor axonal neuropathy, AMAN）。现有理论认为空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）脂多糖与外周神经神经节苷脂的分子模拟触发GBS，实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis, EAN）动物模型提示T细胞对髓鞘P2/P0蛋白的应答参与发病，但先天与适应性免疫细胞间的动态互作——特别是T细胞亚群的异质性及其与B细胞等互作以突破血-神经屏障（blood-nerve barrier, BNB）攻击髓鞘的机制——仍不清楚。既往整体（bulk）研究虽发现GBS患者PBMC中IL-17、IFN-γ等促炎细胞因子升高，但无法解析细胞类型特异性反应及驱动发病的功能性免疫亚群。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）已在多发性硬化和系统性红斑狼疮等自身免疫病中揭示免疫异质性，而GBS外周血的高分辨率单细胞图谱仍较匮乏。为阐明GBS外周免疫失调的细胞组成与互作网络，研究人员对未接受治疗的AIDP亚型GBS患者及匹配健康对照的PBMC进行scRNA-seq，并结合动物模型及组织转录组数据验证，旨在构建GBS外周免疫细胞景观并揭示致病性细胞互作轴。

主要关键技术方法

研究人员纳入2024年6月至11月蚌埠医学院第一附属医院确诊的3例AIDP亚型GBS初治患者及2例年龄性别匹配的健康志愿者（排除其他神经自身免疫病、慢性代谢心血管病、近期手术、感染肿瘤肝肾心功能不全及长期烟酒者），采集EDTA K₂抗凝外周血，Ficoll法分离PBMC并冻存。复苏后检测活性＞80％进入建库，采用10x Genomics Chromium^TMNext GEM Single Cell 3′ Kit v3.1制备单细胞文库，DNBseq-2000平台PE150测序。原始数据用fastp过滤，Cell Ranger 7.2.0比对至GRCh38参考基因组获基因表达矩阵；R/seurat 4.0.6进行标准分析，SoupX去除环境RNA污染，DoubletFinder剔除双细胞，过滤细胞周期及线粒体/血红蛋白/核糖体基因高表达细胞后Harmony批次校正整合。细胞注释由easybio包初注结合人工审校及DeepSeek-R1辅助推断；CellChat 2.1.2分析细胞-细胞互作；monocle3拟时序（pseudotime）分析T细胞分化轨迹；decoupleR v2.10.0推断转录因子及通路活性。外部验证采用GEO小鼠EAN模型scRNA-seq数据集GSE252646及大鼠坐骨神经转录组GSE133750，limma做差异分析，STEM做短时程过表达基因挖掘。

研究结果

Specimen collection（标本收集）

研究人员严格按Asbury标准纳入3例AIDP亚型GBS初治住院患者，排除神经自身免疫病、糖尿病等代谢心血管病、三月内手术、合并感染心衰恶性肿瘤肝肾功能损害及长期烟酒者；2例健康对照为同院体检年龄性别匹配且无异常者，所有受试者签署知情同意，研究经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准（伦科批字〔2020〕第107号）。

PBMC isolation and single-cell sequencing（PBMC分离与单细胞测序）

研究人员用密度梯度离心法自EDTA抗凝血分离PBMC，无血清冻存液保存于－80 ℃，同批次解冻复苏，台盼蓝拒染率＞80％的样本经10x Genomics 3′ v3.1微流控生成Gel Bead-In-EMulsion（GEM），行逆转录、cDNA扩增、片段化、接头连接及索引PCR建库，MGI DNBseq-2000平台150 bp双端测序。

Data quality control and data processing（数据质控与处理）

原始reads经fastp去接头及低质量读段，Cell Ranger比对GRCh38得到表达矩阵。研究人员用SoupX校正背景RNA，DoubletFinder识别并去除假双细胞，滤除高线粒体基因比例及红细胞/核糖体蛋白高表达细胞，经Harmony整合消除批次效应，seurat标准流程降维聚类，最终保留51,358个高质量细胞（初筛57,887个，质控前每样本9,044–12,703个细胞，Valid Barcode率95.6–96.6％，比对率91.4–97.1％，中位检测基因数1,701–2,158）。

Cell annotation（细胞注释）

以Wilcoxon秩和检验找各簇特异标记基因（only.pos=TRUE, min.pct=0.25, logfc.threshold=0.25），easybio初注联合人工校审及DeepSeek-R1推理，鉴定出16个功能各异的免疫亚群。GBS组中活化CD4⁺T细胞及效应记忆CD8⁺T细胞比例显著升高；疾病相关循环巨噬细胞（circulating macrophage, Circ_Macrophage）——外周血中少见的组织来源巨噬细胞样群体——占比＜1％；CD4⁺T细胞亚群重聚类见少量表达CD8⁺T标志的混杂细胞，CD8⁺亚群中两难以定义群体标记为Mix1/Mix2，不影响下游分析。

Cell interaction and pseudotemporal analysis（细胞互作与拟时序分析）

CellChat分析显示CD4⁺/CD8⁺T细胞与髓系细胞间MIF–(CD74+CXCR4)及MIF–(CD74+CD44)配体-受体对信号显著增强；循环巨噬细胞主要经TNF信号通路与其他细胞通讯。monocle3拟时序重建示CD4⁺T细胞沿TH1/TH17偏向分化，CD8⁺T细胞沿效应记忆方向演化，并获各阶段关键标志基因表达动态。

Analysis of transcription factors and signaling pathways（转录因子与信号通路分析）

decoupleR推断示活化T细胞中NF-κB、STAT家族转录因子活性上调，促炎亚群循环巨噬细胞富集TNF/IL-1β介导的炎症通路，免疫调节亚群富集TGF-β及抗炎相关程序。

External data acquisition and processing（外部数据获取与处理）

整合GSE252646（NOD.Aire^GW/?小鼠EAN坐骨神经scRNA-seq）及GSE133750（Lewis大鼠EAN坐骨神经bulk转录组），证实CXCL趋化因子介导的巨噬细胞–免疫细胞互作及TNF信号在神经免疫串扰中的核心地位；大鼠模型中NF-κB信号、Th1分化、趋化因子网络相关基因持续高表达贯穿疾病进程。

The quality control of scRNAseq data（scRNA-seq数据质控）

质控后数据集含51,358个高质量细胞，Harmony整合后各样本细胞簇良好汇聚，UMAP展示去除双细胞前后对比及整合效果，符合单细胞数据质量标准。

The annotation of each cluster（各细胞簇注释）

经典PBMC标记基因（CD3D/CD3E—T细胞，CD19/MS4A1—B细胞，CD14—单核细胞，FCGR3A—NK细胞，FCER1A—树突状细胞）界定主要类群，16个精细亚群含初始/中央记忆/效应记忆T、幼稚/经典/非经典单核、浆细胞样DC等；疾病组活化CD4⁺T及效应记忆CD8⁺T扩增，Circ_Macrophage罕见但可被识别。

The annotation of T cell sub-celltype（T细胞亚型注释）

CD4⁺T细分初始（Naive）、中央记忆（T_CM）、效应记忆（T_EM）、TH1、TH17及调节性T细胞（T_reg），GBS组TH1及TH17比例上升、T_reg相对减少；CD8⁺T分初始、中央记忆、效应记忆及终末分化效应，GBS组效应记忆CD8⁺T显著增多；monocle3示CD4⁺T从初始向TH1/TH17分化轨迹及CD8⁺T向效应记忆演化轨迹。

The annotation of circulating macrophages（循环巨噬细胞注释）

Circ_Macrophage不能归入经典M0/M1/M2，依高表达基因功能定义为凋亡相关、免疫调节、炎症活化等8个亚群，剔除CD247/TRAC/ITK阳性T细胞污染群；GO/KEGG示免疫调节亚群富集抗原提呈与免疫负调通路，炎症活化亚群富集TNF/NF-κB及IL-1β信号。

The cell-cell interaction and molecular regulation（细胞-细胞互作与分子调控）

CellChat网络示GBS组MIF–(CD74+CXCR4/CXCR4缺失标注为CD44共受体)在T细胞-髓系互作中权重最大，TNF–TNFRSF1A/TNFRSF1B主导巨噬细胞向外通讯；小鼠模型证实CXCL家族配体-受体对介导神经内巨噬细胞互作；大鼠EAN进程持续过表达基因富集NF-κB、Th1分化及趋化因子信号，支持外周T细胞分化–趋化因子分泌轴驱动GBS炎性神经病。

讨论与结论

研究人员通过对未治AIDP亚型GBS患者及健康对照PBMC的高分辨率scRNA-seq，辅以小鼠EAN模型及大鼠神经组织转录组验证，构建了GBS外周免疫细胞单细胞转录组图谱。研究发现GBS患者外周血活化CD4⁺T细胞（TH1/TH17偏向）及效应记忆CD8^{+ T细胞扩增，循环巨噬细胞存在功能异质性的炎症活化与免疫调节亚群，并揭示由促炎T细胞亚群与循环巨噬细胞共刺激、相互强化构成的MIF–(CD74+CXCR4/CD44)及TNF信号介导的细胞互作回路放大外周神经炎症。整合动物模型证实CXCL趋化因子及TNF信号为神经免疫串扰核心，大鼠EAN病程中NF-κB/Th1/趋化因子网络基因持续高表达。综上，本研究确立外周免疫细胞串扰为GBS疾病进展的关键驱动因素，鉴定出可干预的分子靶点（MIF、TNF、CXCL通路相关分子），所提供的高质量整合数据集为AIDP亚型GBS的异常免疫活化及细胞互作研究奠定重要基础资源。}