PM534——一种新型秋水仙碱结合位点微管蛋白抑制剂(Colchicine Site Tubulin Inhibitor)，具有广谱抗肿瘤及克服耐药活性的研究

《Molecular Cancer Therapeutics》：PM534, a Novel Colchicine Site Tubulin Inhibitor with Broad-Spectrum and Resistance-Overcoming Antitumor Activity Open Access

　　

摘要：本研究评估了一种新型秋水仙碱结合域(Colchicine-Binding Domain, CBD)抑制剂PM534在癌症治疗中的潜力。PM534对包括乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌在内的14种人癌细胞系表现出强效体外(in vitro)活性，半数生长抑制浓度(GI50)处于低纳摩尔范围。连续(72小时)及短时(1–24小时)暴露均产生不可逆效应，诱导G2–M细胞周期阻滞及多核化。此外，PM534抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的黏附功能(IC50= 2.3 nmol/L)，其效力显著强于秋水仙碱(IC50= 1,800 nmol/L)；在浓度低至1.6 nmol/L时延迟伤口愈合迁移实验中的伤口闭合，且在浓度≥4 nmol/L时完全抑制迁移；PM534在浓度≥0.5 nmol/L时即破坏毛细血管样网络形成及侵袭，且不引起细胞毒性。体内(in vivo)实验中，PM534在六种异种移植模型(卵巢癌A2780和ES-2、三阴性乳腺癌MDA-MB-231和HCC1937、前列腺癌VCaP和22Rv1)中显示出强效抗肿瘤活性，显著延长各模型中位生存时间且未引起全身毒性迹象。机制上，PM534诱导肿瘤组织发生凋亡、有丝分裂灾难(Mitotic Catastrophe)及坏死。重要的是，PM534在过表达多药耐药蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp/ABCB1)或β-III微管蛋白(β-III tubulin)的模型中仍保持疗效，克服了限制其他微管结合药物应用的常见耐药机制。综上所述，这些发现突显了PM534作为一种前景广阔的抗肿瘤候选药物，对多种难治性恶性肿瘤具有强效活性。目前一项I期临床试验(NCT#5835609)正在评估PM534对晚期实体瘤患者的治疗潜力。

论文解读：PM534——一种新型秋水仙碱位点微管抑制剂具有广谱及克服耐药的抗肿瘤活性

研究背景与立项依据

微管靶向药物(Microtubule-Targeting Agents, MTAs)如长春碱类(Vinca alkaloids)和紫杉烷类(Taxanes)是临床重要的化疗药，但通过结合微管蛋白(tubulin)上的长春碱位点（微管去稳定）或紫杉烷位点（微管稳定）发挥作用。现有MTAs面临两大局限：严重外周神经毒性，以及因ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白（主要是P-糖蛋白/P-gp/MDR1/ABCB1）介导的药物外排和多药耐药(Multidrug Resistance, MDR)，或β-III微管蛋白(β-III tubulin)亚型过表达导致的获得性/原发性耐药。秋水仙碱结合域(Colchicine-Binding Domain, CBD)虽是微管蛋白上最早发现的调节位点，且秋水仙碱(colchicine)等CBD配体已用于痛风等非肿瘤疾病，但因溶解度和药代动力学缺陷，尚无CBD结合抗肿瘤药物获批临床。因此，开发具有高亲和力、良好成药性且能规避上述耐药机制的新型CBD微管去稳定剂(Microtubule-Destabilizing Agent, MDA)具有重要临床意义。本研究针对新型海洋海绵来源合成类似物PM534（PM742的合成类似物），系统评价其体外/体内活性、抗血管生成作用、克服P-gp及β-III tubulin耐药的能力及作用机制。

主要关键技术方法

研究人员采用：(1) 体外细胞增殖抑制实验(MTT法)及药物洗脱(washout)实验测定14种人肿瘤细胞系（乳腺、卵巢、前列腺）及耐药株(LoVo/LoVo-DOX、HeLa/HeLa β-III)的半数生长抑制浓度(GI₅₀)；(2) EBI(N,N′-乙烯双(碘乙酰胺))竞争结合实验验证PM534占据CBD；(3) 流式细胞术分析细胞周期分布及免疫荧光观察微管形态与多核化；(4) 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能实验（黏附、划痕愈合、Transwell侵袭、Matrigel毛细血管网络形成/破坏）评估抗血管生成活性；(5) MDR1(MDR1/ABCB1)转染MDCKII细胞双向通透实验测定转运动力学参数(K_m、V_max)；(6) 裸鼠(Foxn^nu/nu)及SCID小鼠异种移植模型（6种肿瘤）静脉给药评估体内抑瘤率、生存期及毒性（体重、血生化、血常规）；(7) 肿瘤组织苏木精-伊红(H&E)染色、Hoechst 33258凋亡核染色、免疫组化(IHC)检测裂解半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)及血管内皮标记Endomucin，Western blot检测凋亡及周期相关蛋白(Cyclin B1、磷酸化组蛋白H3/pH3 Ser¹⁰)及耐药蛋白表达。

研究结果

PM534 demonstrates potent and sustained antitumor activity across multiple tumor types（PM534在多种肿瘤类型中显示强效且持续的抗肿瘤活性）

研究人员用0.06–240 nmol/L PM534连续处理14种人癌细胞系72小时，测得平均GI₅₀为2 ± 0.5 nmol/L（范围1.1–3.0 nmol/L）。EBI竞争实验显示PM534浓度依赖性占据CBD（100 nmol/L明显位移，1000 nmol/L完全取代EBI结合），证实其与秋水仙碱位点高亲和力结合。短时暴露（1小时）洗脱后仍有持久不可逆抑制效应（中位GI₅₀25.7 nmol/L），24小时暴露GI₅₀与72小时相当（约2 nmol/L），表明强效结合及长滞留时间。10 nmol/L PM534处理24小时后，乳腺癌(MDA-MB-231)、卵巢癌(A2780)、前列腺癌(22Rv1)细胞G₂–M期比例显著升高（分别达64.5%、63.6%、53.1% vs 对照组17.4%、14.5%、26.2%），Cyclin B1和磷酸化组蛋白H3(pH3 Ser¹⁰)上调，免疫荧光可见典型多核化异常分裂细胞，证实PM534为微管去稳定剂，通过G₂–M阻滞及有丝分裂灾难发挥抗肿瘤作用。

PM534 disrupts HUVEC invasion and capillary formation（PM534破坏HUVEC侵袭及毛细血管形成）

PM534抑制HUVEC黏附(IC₅₀= 2.3 nmol/L，比秋水仙碱强约800倍)，1.6 nmol/L延迟伤口愈合迁移，≥4 nmol/L完全抑制迁移；浓度依赖性抑制Transwell侵袭（5 nmol/L完全阻断）；在毛细血管网络形成实验中，≥2.5 nmol/L干扰成管，5–10 nmol/L完全阻止网络形成；对已形成的毛细血管网络，0.5 nmol/L即有轻微破坏，2.5 nmol/L明显破坏，5 nmol/L致血管网崩解。上述浓度下HUVEC存活率≥70%（≤10 nmol/L时基本无细胞毒性），表明抗血管生成作用非细胞毒继发效应。

PM534 demonstrates robust antitumor activity across multiple xenograft models（PM534在多种异种移植模型中显示强效体内抗肿瘤活性）

在卵巢癌(A2780、ES-2)、三阴性乳腺癌(MDA-MB-231、HCC1937)、前列腺癌(VCaP、22Rv1)异种移植小鼠中，每周一次静脉给予PM534（2.5或5 mg/kg，共3周），与安慰剂相比显著缩小肿瘤体积（如MDA-MB-231达完全缓解≤63 mm³，其余模型均有统计学显著缩小），并显著延长中位生存期（A2780: 26 vs 12天；MDA-MB-231: 82 vs 33天等，均P<0.05）。治疗期间仅出现可逆性轻微体重下降（最低-9.8%），无明显局部或全身毒性，血生化及血常规仅见轻度可逆变化，证实治疗窗口良好。

PM534 induces apoptosis, mitotic catastrophe, and necrosis in vivo and a potent antitumor effect by activating caspase-3 apoptosis and the reduction of blood vessels leading to necrosis（PM534在体内诱导凋亡、有丝分裂灾难及坏死，并通过激活caspase-3凋亡和减少血管导致坏死发挥强效抗肿瘤作用）

给药后取肿瘤组织分析：PM534组凋亡细胞核数、有丝分裂灾难细胞数较安慰剂显著增多（如A2780凋亡核45.5±25 vs 4.6±2.1，P=0.0159；HCC1937有丝分裂灾难13.8±9.2 vs 3.8±1.1，P=0.0079）；坏死面积比例显著增加（A2780 40% vs 1%，MDA-MB-231 95% vs 50%等）。IHC显示Cleaved caspase-3阳性信号显著增强（如MDA-MB-231: 6498 vs 1664像素/mm²），内皮标记Endomucin阳性血管密度显著降低（如22Rv1: 25 vs 317像素/mm²），表明PM534兼具直接杀伤肿瘤细胞（凋亡/有丝分裂灾难）与破坏肿瘤血管（血管崩解→缺血坏死）的双重机制。

PM534 overcomes tubulin resistance with superior antitumoral activity（PM534克服微管蛋白相关耐药并具有优越抗肿瘤活性）

体外：P-gp过表达LoVo-DOX细胞GI₅₀为5.8 nmol/L（亲本LoVo为1.9 nmol/L），β-III tubulin过表达HeLa β-III GI₅₀为1 nmol/L（亲本HeLa为1.1 nmol/L），活性基本不受耐药蛋白影响。MDR1双向转运实验测得PM534被P-gp转运的K_m=12.84 μmol/L，V_max=10.3 pmol/min/pmol蛋白，细胞内游离药物远低于K_m故外排可忽略。体内：单次静脉给予PM534(5 mg/kg)对LoVo及LoVo-DOX异种移植瘤抑瘤效果相当（中位体积114.9 vs 131.4 mm³，均显著小于安慰剂及紫杉醇组；紫杉醇对LoVo-DOX无效P=0.48）；对HeLa及HeLa β-III异种移植瘤同样有效（HeLa β-III组163.4 mm³vs 安慰剂257.4 mm³，P<0.05，优于紫杉醇239.9 mm³），证实PM534可克服P-gp介导及β-III tubulin过表达介导的多药耐药。

讨论与结论总结

微管靶向药物因结合位点不同分为微管稳定剂（紫杉烷位点）和微管去稳定剂（长春碱、秋水仙碱等位点）。秋水仙碱结合域(CBD)化合物因溶解度差和药代缺陷长期未能进入抗癌临床。PM534作为新型CBD高亲和力配体，与CBD结合解离慢、滞留时间长，引起微管解聚、G₂–M阻滞、多核化及不可逆生长抑制。其抗血管生成/血管破坏作用通过抑制HUVEC功能及减少肿瘤内Endomucin阳性血管实现，协同促进肿瘤坏死。最重要的是，PM534因极高靶亲和力和极低游离胞内浓度使其不被P-gp有效外排，且不受β-III tubulin过表达影响，克服了经典MTAs的两大主要耐药机制。综合体外广谱纳摩尔级活性、体内多瘤种显著抑瘤及延寿、可接受毒性谱及克服MDR特性，PM534是极具前景的耐药肿瘤治疗候选药物。目前PM534的I期临床试验(NCT#5835609)已在晚期实体瘤患者中开展，以进一步评估其临床治疗潜力。该研究发表于《Molecular Cancer Therapeutics》。