CADM1作为骨肉瘤免疫治疗靶点的鉴定及其新型抗体-药物偶联物在临床前骨肉瘤模型中的评价

《Molecular Cancer Therapeutics》：Identification of CADM1 as an Immunotherapeutic Target and Evaluation of a Novel CADM1-Targeting Antibody–Drug Conjugate in Preclinical Osteosarcoma Models Open Access

　　

由于缺乏已验证的骨肉瘤细胞表面特异性靶点，该病患者长期以来无法从抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate, ADC）治疗中获益，而ADC疗法在多种实体瘤和血液恶性肿瘤患者中已显示出疗效。研究人员此前采用综合表面组学图谱分析策略，鉴定出骨肉瘤特异性细胞表面抗原，这些抗原在骨肉瘤中高度表达，而在正常组织中表达极低。基于此，CADM1被选中作为ADC开发的靶点。研究者在骨肉瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）细胞系中，体外测试了携带tesirine载荷（SG3249）的CADM1靶向ADC。在体内，研究者在六种CADM1表达的骨肉瘤PDX模型中进行了验证。CADM1 ADC在骨肉瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤细胞系中均显示出显著的体外抗肿瘤活性。此外，该ADC在所有六种骨肉瘤PDX模型中均有效缩小了肿瘤体积并延长了无事件生存期（event-free survival, EFS）。值得注意的是，CADM1 ADC在一个模型（OS2）中实现了主要完全缓解（major complete response, MCR），在两种模型（OS1和OS33）中实现完全缓解（complete response, CR），在三种模型（OS9、OS17和OS31）中实现部分缓解（partial response, PR）。基于这些结果，针对骨肉瘤及其他CADM1表达的儿童实体瘤开展CADM1靶向治疗的临床开发是合理的。

该研究发表于《Molecular Cancer Therapeutics》，聚焦于骨肉瘤这一儿童及青少年最常见的原发性骨肿瘤。尽管自20世纪80年代辅助化疗实施以来，局限性骨肉瘤患者的长期生存率已达60%至70%，但近四十年来生存改善十分有限。虽然对骨肉瘤生物学的深入认识揭示了其异质性和分子异常，但可靶向的反复突变寥寥无几，导致新型治疗策略的需求极为迫切。免疫治疗领域，靶向细胞表面抗原的ADC已在血液恶性肿瘤和多种实体瘤中展现出前景，然而针对骨肉瘤的ADC临床试验结果令人失望，部分原因在于已知的骨肉瘤细胞表面抗原匮乏，以及载荷-药物偶联物的抗肿瘤活性不足。在此背景下，研究人员此前开发了一种整合蛋白质组学和转录组学数据的高通量表面组学分析方法，鉴定出LRRC15、MMP14、MRC2和CD276等高置信度骨肉瘤细胞表面抗原，靶向这些蛋白的ADC在临床前测试中显示 encouraging 的抗肿瘤活性。CADM1作为此次表面组学分析中新鉴定的靶点，是一种在细胞黏附、识别、免疫应答和肿瘤抑制等生物学过程中发挥重要作用的细胞表面糖蛋白，但针对CADM1的骨肉瘤治疗此前尚未建立。研究人员据此假设CADM1靶向ADC可能成为骨肉瘤的新型有效治疗选择。

研究采用的关键技术方法包括：整合定量质谱蛋白质组学与RNA测序（RNA-seq）的表面组学分析技术，用于靶点筛选与验证；流式细胞术用于CADM1蛋白表达检测；免疫组织化学（IHC）染色及H-score评分系统用于组织表达谱分析；基于IncuCyte活细胞成像系统的ADC内化及旁观者杀伤效应（bystander effect）检测；采用alamarBlue法的细胞活力测定；以及基于CB17SC scid^-/-小鼠的六种骨肉瘤PDX模型体内药效学评价（样本来源于Pediatric Preclinical In Vivo Testing consortium），通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验和Wilcoxon秩和检验进行生存分析。

**蛋白质组学分析确证CADM1在骨肉瘤中的表达**：通过定量质谱技术对骨肉瘤细胞系和PDX模型的表面蛋白进行谱图分析，确认CADM1在骨肉瘤中频繁表达，支持其作为治疗靶点的适用性。

**转录组学分析确认CADM1过表达**：将TARGET项目骨肉瘤样本的RNA-seq数据与Genotype-Tissue Expression项目中29种正常组织进行比较，CADM1在骨肉瘤中的表达（均值136.4 TPM，中位106.3 TPM）显著高于正常组织（除甲状腺、睾丸、垂体和脑组织外，多数组织不超过30 TPM）。层次聚类分析显示CADM1在TARGET队列和17种骨肉瘤细胞系中稳定表达，且在多数儿童癌症类型中，骨肉瘤的CADM1表达水平最高。

**CADM1作为骨肉瘤细胞表面抗原的验证**：流式细胞术检测到7种骨肉瘤细胞系均存在CADM1蛋白表达。IHC分析显示，70例患者样本中79%为CADM1阳性，19例PDX模型全部阳性；正常组织微阵列中，胃腺和睾丸呈中度表达（H-score分别为120和180），肾、肺、胰腺、扁桃体和肝脏低表达（H-score≤60），皮肤、卵巢、小脑、骨骼肌和心肌则无表达。

**骨肉瘤细胞系中ADC载荷的体外测试**：在8种骨肉瘤细胞系中测试9种商用载荷，半最大抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）数据显示，SG3199（tesirine释放的弹头分子）最为强效，这与DNA损伤剂作为骨肉瘤治疗 backbone 的临床模式一致，且吡咯并苯二氮?二聚体的疏水性有利于产生旁观者效应。

**CADM1 ADC与CD19 ADC的特性**：采用抗CADM1单克隆抗体（clone PTA021_A1）与SG3249偶联，经尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）和疏水相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography, HIC）表征，加权平均药物抗体比（drug-to-antibody ratio, DAR）为3.76。

**CADM1 ADC在骨肉瘤模型中的选择性体外抗肿瘤活性**：CADM1 ADC在HOS、SaOS2、OS17和OS31四种骨肉瘤细胞系中显著抑制增殖，而对CADM1阴性的K562白血病细胞系作用微弱；游离载荷SG3199无选择性，CD19 ADC同型对照无显著毒性。

**CADM1 ADC在其他儿童实体瘤中的选择性体外抗肿瘤活性**：流式细胞术证实横纹肌肉瘤RH30细胞和神经母细胞瘤IMR-32、BE(2)-C细胞高表达CADM1，CADM1 ADC对这些细胞系有效降低活力；而CADM1阴性的Ewing肉瘤MDA-SA140细胞对应较高的IC₅₀值。

**CADM1 ADC的内化与旁观者杀伤效应**：在HOS、OS17和OS31细胞中，CADM1 ADC处理5天后观察到显著内化，第4天起达到稳态平台。将CADM1 ADC处理HOS后的条件培养基转移至未处理的K562细胞，可诱导K562增殖抑制，证实旁观者效应；而K562条件培养基无此效应，SG3199处理则为阳性对照。这表明ADC内化后经溶酶体酶解释放游离载荷，通过被动扩散杀伤周围CADM1阴性细胞。

**CADM1 ADC在骨肉瘤PDX模型中的体内抗肿瘤活性**：基于既往使用相同吡咯并苯二氮?载荷的研究，选择3 mg/kg单剂量腹腔给药。该ADC在所有6种模型中显著延长EFS（T-C平均值98.34天，P<0.05），结果分别为：OS2模型达MCR，OS1和OS33达CR，OS9、OS17和OS31达PR。CD19 ADC对照组中，两种模型为PD1，三种为PD2，一种为PR。平均最大体重下降10.1%。RNA-seq和IHC H-score显示OS1的CADM1表达最高。CADM1阴性Ewing肉瘤PDX模型（MDA-SA140）经CADM1 ADC治疗后出现PD，进一步验证靶点特异性。

讨论部分系统回顾了骨肉瘤治疗面临的挑战：靶向治疗临床试验尚未证实可治愈，免疫检查点抑制剂单药效果不佳，因此ADC等新型策略亟需发展。研究强调其整合表面组学方法的成功应用，并指出CADM1在骨母细胞 transient 表达、可作为骨肉瘤诊断标志物的特性。特别值得注意的是，骨肉瘤PDX模型在既往Pediatric Preclinical Testing Program和Consortium测试中很少出现缓解反应，而本研究中CADM1 ADC与近期获批的B7-H3 ADC有望改变这一局面。关于载荷选择，吡咯并苯二氮?二聚体SG3199的强效性与LRRC15靶向ADC的研究结果一致。研究人员正在开发三种符合GMP标准的CADM1 ADC，采用不同连接子-载荷组合以筛选最佳候选。

研究亦坦诚其局限性：未充分评估CADM1在正常表达组织中的 on-target, off-tumor 毒性；基于小鼠模型的设计无法完全模拟人源抗CADM1抗体与鼠源CADM1蛋白的相互作用；未来需在人体研究中评估剂量限制性毒性及物种特异性反应。此外，CADM1在多种其他实体瘤中的高表达提示更广泛的临床应用潜力，但超出本研究范围。

**研究结论**：综合表面组学分析鉴定CADM1为骨肉瘤细胞靶点，并在PDX模型和人源肿瘤样本中得到验证。CADM1 ADC的临床前测试显示 promising 的缓解反应，支持其在骨肉瘤治疗中的潜力。这些发现为开发针对骨肉瘤及其他儿童实体瘤的CADM1靶向细胞毒药物指明了方向。