拮抗硫氧还蛋白1（Trx1）酪氨酸49（Tyr49）硝化修饰激活其变构（Allosteric Activation）发挥缺血性脑卒中神经保护作用——川芎嗪（Tetramethylpyrazine, TMP）的作用机制

《Rangelands》：Allosteric activation of Trx1 by antagonizing nitrative modification at tyrosine 49 confers neuroprotection against ischemic stroke

　　

摘要：缺血性脑卒中（Ischemic Stroke）仍是全球致死率与致残率居首的疾病之一，有效治疗手段有限。川芎嗪（Tetramethylpyrazine, TMP）是从中药川芎（Ligusticum chuanxiong）中提取的天然生物碱，临床已证实对缺血性脑卒中有效，但其直接分子靶点与作用机制长期未明。研究人员整合双功能光亲和TMP探针、细胞培养稳定同位素标记（SILAC）及活性导向蛋白谱分析（ABPP），鉴定胞质硫氧还蛋白1（Thioredoxin 1, Trx1）为TMP的直接结合靶点。研究表明TMP特异性结合Trx1的Tyr49（Y49）位点，拮抗过氧亚硝基诱导的Trx1 Tyr硝化失活，并作为变构激活剂增强Trx1还原酶活性及其与凋亡信号调节激酶1（Apoptosis Signal-regulating Kinase 1, ASK1）的相互作用，进而抑制ASK1-p38/JNK信号级联活化。基因敲除Trx1或ASK1，或用过氧亚硝基供体SIN-1诱导Trx1硝化，均可完全取消TMP的神经保护效应。本研究不仅阐明了TMP临床疗效的分子机制基础，还将Trx1 Y49鉴定为可成药变构位点，为缺血性脑卒中及其他伴硝化应激疾病的抗硝化治疗策略提供了新依据。

论文解读：拮抗Trx1 Tyr⁴⁹硝化修饰变构激活Trx1介导TMP抗缺血性脑卒中神经保护作用的机制研究

一、研究背景与立题依据

缺血性脑卒中占全部脑血管意外约80%，再灌注（I/R）损伤中过氧亚硝基（Peroxynitrite, ONOO^?）可致蛋白酪氨酸硝化（Tyrosine Nitration），其中硫氧还蛋白1（Trx1） Tyr⁴⁹硝化已被证实使其还原酶活性丧失。川芎嗪（Tetramethylpyrazine, TMP）在中国临床应用于缺血性脑卒中治疗逾50年，但缺乏明确分子靶点与机制阐释，制约其理性药物开发。本研究旨在鉴定TMP直接作用靶点，阐明其通过调控Trx1硝化及变构激活发挥神经保护的分子机制。本研究发表于《Rangelands》。

二、主要关键技术方法

采用Sprague-Dawley（SD）大鼠建立大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）体内模型，原代海马神经元及SH-SY5Y细胞建立氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）体外模型；合成含重氮嘧啶-炔基的双功能光亲和探针TMP-P并结合细胞培养氨基酸稳定同位素标记-活性导向蛋白谱分析（SILAC-ABPP）钓靶与定量质谱鉴定；微量热涌动（MST）测结合亲和力（K_D）；细胞热位移分析（CETSA）与药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）验证细胞内靶标结合；免疫沉淀（IP）/Co-IP检测Trx1硝化水平及Trx1-ASK1复合物；CRISPR/Cas9构建Trx1与ASK1基因敲除（KO）及Y49A点突变过表达细胞株；圆二色谱（CD）与色氨酸荧光淬灭检测蛋白构象变化；分子对接与分子动力学（MD）模拟结合模式；Western Blot检测ASK1-p38/JNK通路磷酸化水平；TTC、HE、Nissl染色评估脑梗死体积与组织学损伤。

三、研究结果

3.1. TMP alleviates cerebral I/R injury in a rat MCAO/R model

研究人员通过大鼠MCAO/R模型发现，TMP（20、40、80 mg/kg ip）剂量依赖性改善神经功能缺损评分，减小TTC染色所示脑梗死体积，HE与Nissl染色显示皮质及海马区神经元排列紊乱、空泡化与尼氏体丢失减轻，证实TMP在体内对脑I/R损伤具明确神经保护作用。

3.2. TMP attenuates OGD/R-induced neuronal injury and mitochondrial dysfunction

在OGD/R处理的原代神经元与SH-SY5Y细胞中，TMP（5–20 μM）浓度依赖提高细胞活力（CCK-8、结晶紫染色），恢复JC-1与TMRM所示线粒体膜电位，降低DCFH-DA检出的ROS水平，减少Hoechst 33258所示染色质凝集与核固缩，下调Cleaved Caspase-3与Bax/Bcl-2比值，表明TMP通过维持线粒体功能、抑制氧化应激与凋亡发挥体外神经元保护。

3.3. SILAC-ABPP identifies Trx1 as a direct target of TMP

研究人员合成保留TMP生物活性的光亲和探针TMP-P，经SILAC-ABPP竞争实验筛选出82个（原位）与156个（体外）高置信度候选蛋白，交叉脑缺血相关基因数据库锁定Trx1与FABP5；MST显示TMP与Trx1特异性结合（K_D= 0.15 μM），与FABP5无显著结合；共聚焦显示TMP-P点击化学荧光与内源Trx1高度共定位（Pearson系数0.983），确证Trx1为TMP直接靶蛋白。

3.4. Trx1 is essential for TMP-mediated neuroprotection

竞争性Pull-down显示游离TMP剂量依赖抑制TMP-P与重组及内源Trx1结合；DARTS与CETSA证明TMP特异增加Trx1热与蛋白酶稳定性而不影响β-actin、TrxR1、Keap1、VDAC1；CRISPR/Cas9敲除Trx1后，TMP无法恢复OGD/R下细胞活力、抑制凋亡或维持ΔΨm，表明Trx1是TMP神经保护效应所必需的。

3.5. TMP allosterically activates Trx1 by inhibiting nitrative modification at Y49

OGD/R显著降低Trx1活性但不改变其总蛋白量；TMP恢复Trx1活性。光交联-质谱定位TMP-P标记残基（S44、S46、E47、L97、E98、E103、L104）均邻近Y49。IP-3-NT抗体及LC-MS/MS证实OGD/R致Trx1 Y49硝化（+44.9851 Da），TMP抑制此硝化；Y49A突变削弱TMP结合且取消TMP对Trx1活性激活。色氨酸荧光淬灭与CD光谱示TMP诱导Trx1二级结构改变（α螺旋↓、β折叠↓），分子对接与40 ns MD模拟显示TMP与Y49形成π-π堆积及与K48氢键，使催化半胱氨酸Cys³²–Cys³⁵间距增大，稳定还原活性构象——证明TMP通过结合Y49拮抗硝化、变构激活Trx1。

3.6. TMP stabilizes the Trx1-ASK1 complex and suppresses redox-dependent signaling

Co-IP显示OGD/R破坏Trx1-ASK1结合并激活ASK1自磷酸化及下游p38/JNK磷酸化，TMP恢复Trx1-ASK1复合物并抑制p-ASK1、p-p38、p-JNK；该效应依赖Y49（Y49A突变体无此作用）。ASK1基因敲除取消TMP对OGD/R细胞存活改善及对ASK1-p38/JNK抑制，说明TMP经变构激活Trx1→稳定Trx1-ASK1→抑制ASK1-p38/JNK轴发挥保护。

3.7. TMP alleviates ischemic injury by suppressing Trx1 nitration and restoring Trx1 activity

体内MCAO/R致脑组织中Trx1硝化↑、活性↓，TMP剂量依赖抑制硝化并恢复活性，增强Trx1-ASK1结合，下调p-ASK1/p-p38/p-JNK；过氧亚硝基供体SIN-1（1 mg/kg）外源性诱导Trx1硝化、抵消TMP对Trx1活性恢复及神经功能、梗死体积、组织学损伤的改善，IHC与WB佐证。证实TMP体内保护依赖于拮抗Trx1 Y49硝化及保全Trx1-ASK1-ASK1/p38/JNK通路抑制。

四、讨论与结论翻译

讨论指出本研究首次用光亲和SILAC-ABPP鉴定TMP直接靶点为Trx1，确立Y49为Trx1可成药变构位点及TMP为其首例变构激活小分子；区别于直接修饰氧化还原活性中心Cys^32/35，TMP结合Y49拮抗硝化诱导失活并变构稳定还原态Trx1，促进与ASK1结合抑制促凋亡信号，为抗硝化应激治疗缺血性脑卒中提供新范式。SIN-1回补实验证实该保护机制特异地依赖抑制Trx1硝化而非其他PTM。

结论（翻译）：综上，本研究确定Trx1是介导TMP神经保护效应的直接功能靶点。TMP结合Trx1 Tyr⁴⁹，拮抗其硝化失活并使Trx1发生变构激活，从而稳定Trx1-ASK1（凋亡信号调节激酶1）复合物并抑制下游ASK1-p38/JNK信号通路。基因或药理学干扰此轴完全废除TMP的保护作用。研究结果不仅阐明TMP临床效用的分子机制，还将Trx1 Tyr⁴⁹鉴定为可成药变构位点，为缺血性脑卒中及伴硝化应激相关疾病提供了靶向氧化还原的新型治疗策略。