《Reproductive BioMedicine Online》：Simplified warming of vitrified human embryos: comprehensive analysis of diverse morphological qualities and developmental stages
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清谷正（Masashi Shioya）、冈部-木下美希（Miki Okabe-kinoshita）、古贺香织（Kaori Koga）、藤田真希（Maki Fujita）、高桥敬一（Keiichi Takahashi）高桥妇女诊所（Takahashi Women’s Clinic）
清谷正（Masashi Shioya）、冈部-木下美希（Miki Okabe-kinoshita）、古贺香织（Kaori Koga）、藤田真希（Maki Fujita）、高桥敬一（Keiichi Takahashi）
高桥妇女诊所（Takahashi Women’s Clinic），日本千叶县千代田区新町18-14-6F，邮编260-0028
摘要
研究问题
简化的一步或两步解冻方案是否对处于不同发育阶段、具有不同形态特征以及处于不同囊胚期的玻璃化人类胚胎有效且安全？
研究设计
这项回顾性队列研究在一家试管婴儿中心进行，分析了2024年1月至12月期间进行的1501个单胚胎移植周期（150个分裂期胚胎；1351个囊胚）。研究比较了传统三步解冻方案（解冻液1分钟、稀释液2分钟、洗涤液3分钟，n=742）与简化方案：两步解冻（解冻液1分钟，随后稀释液2分钟，n=461）和一步解冻（解冻液1分钟，n=298）的效果。分别对分裂期胚胎和囊胚进行了分析。对于囊胚，还根据发育阶段、形态特征和囊胚期进行了多变量逻辑回归和亚组分析。
研究结果
对于分裂期胚胎，所有方案的存活率均为100%，持续妊娠率也相当（分别为11.1%、12.5%、10.8%；p=1.0000）。对于囊胚，解冻后的存活率（分别为100%、99.3%、99.6%；p=0.1112）和持续妊娠率（分别为47.7%、46.2%、43.9%；p=0.5765）在三种方案间无显著差异，即使考虑了混杂因素也是如此。这种等同性在所有亚组中都得到了一致观察，包括发育阶段（完全囊胚：43.2%、39.6%、33.7%，p=0.3111；扩展囊胚：49.6%、49.5%、49.1%，p=0.9950）、形态特征（低等级：27.5%、23.5%、23.4%，p=0.7636；高等级：52.1%、51.6%、48.4%，p=0.6390）以及囊胚期（第5天：52.7%、52.9%、50.3%，p=0.8234；第6天：34.4%、28.5%、27.4%，p=0.4088）。
结论
无论发育阶段、形态特征或囊胚期如何，简化的一步或两步解冻方案对玻璃化人类胚胎都是有效的。
引言
卵子和胚胎的冷冻保存方法从慢速冷冻转变为玻璃化技术，使得其存活率得以维持在极高的水平，而且“全部冷冻”的策略避免了卵巢过度刺激综合征，并在胚胎移植前准备了适当的着床环境（Bourdon等人，2021年）。此外，这还扩展了辅助生殖技术在植入前遗传检测和生育力保存中的应用可能性（Bosch等人，2020年；Casciani等人，2023年）。近年来，随着玻璃化及其后续解冻成为标准的试管婴儿实验室操作，研究重点转向了优化实验室工作量（Gallardo等人，2019年；Sciorio等人，2024年；Martinez-Rodero等人，2025年）。尽管玻璃化方案通常建议将卵子和胚胎暴露在平衡溶液中长达15分钟，但最近的研究表明，缩短暴露时间并不会对其存活率产生不利影响。研究表明，快速的细胞内水分去除就足以实现成功的冷冻保存（Gallardo等人，2019年），并且减少平衡溶液中的暴露时间对卵子和胚胎的存活率或发育潜力没有负面影响（Liebermann等人，2024a；Schiewe等人，2024年；Wozniak等人，2024年；Costa-Borges等人，2025年；Martinez-Rodero等人，2025年）。
冷冻保存程序的简化也应用于解冻方案，特别是通过省略了顺序复水步骤。传统的解冻方案使用多种溶液来逐步创建渗透压，这一过程基于冷冻生物学的原理，强调在避免可能导致不可逆细胞损伤的低渗压的同时安全地复水的重要性（Rall和Fahy，1985年；Mazur和Schneider，1986年；Pedro等人，1997年；Kasai，2002年；Vanderzwalmen等人，2020年）。尽管这种谨慎的方法被证明是有效的，但它依赖于操作者的技能且耗时较长，这在涉及大量试管婴儿周期的实验室工作中带来了挑战。因此，人们越来越希望简化解冻方案以提高效率并减少胚胎在培养箱外的时间（Manns等人，2021年）。最近的研究表明，简化的解冻方案不会对玻璃化囊胚的临床结果产生负面影响（Jiang等人，2024年；Bartolacci和Albertini，2024年；Liebermann等人，2024b；Karagianni等人，2025年；Licata等人，2025年）。这种方法通过仅使用解冻液（TS）来修改程序，省略了传统方案中通常需要的稀释液（DS）和洗涤液（WS）等渗透溶液的顺序使用。最近的一项前瞻性队列研究进一步证明了简化解冻方案的临床可靠性。Karagianni等人（2025年）进行的前瞻性分析表明，简化解冻方案（即胚胎在37°C下暴露于解冻液1分钟）产生的胚胎移植结果与传统多步骤方法相当。具体来说，在临床妊娠率（56.86% vs. 57.36%）、持续妊娠率（50.62% vs. 51.12%）和活产率（49.38% vs. 51.12%）方面，简化解冻方案与传统方案之间没有显著差异。此外，最近的大规模临床证据也验证了简化解冻方案的安全性，表明使用该方案出生的1,266名婴儿的胎龄和出生体重与使用传统方案出生的婴儿没有显著差异（Liebermann等人，2026年）。这些发现挑战了长期以来认为逐步复水对于维持胚胎存活率至关重要的冷冻生物学观点。
然而，现有文献中仍有两个关键问题尚未得到解答。首先，尚不清楚这种简化方案是否对不同发育阶段、形态特征和囊胚期的胚胎有效。其次，大多数研究仅关注囊胚，而简化解冻程序对分裂期胚胎的突然渗透压影响尚未得到充分了解，分裂期胚胎具有根本不同的细胞结构和生理功能。之前的一项体外研究表明，简化解冻方案并未损害分裂期胚胎的存活率和后续发育潜力。然而，该研究并未评估其对妊娠和流产的影响（Shioya等人，2025年）。
本研究旨在通过调查在解冻过程中省略逐步渗透稀释步骤是否会影响具有不同特征的人类胚胎的临床结果来填补这些关键知识空白。为此，对三种解冻方案进行了大规模的回顾性比较分析，包括传统的三步解冻方案、中间两步解冻方案和一步解冻方案。
章节片段
研究设计
这项回顾性队列研究得到了研究机构伦理审查委员会的批准（方案编号TWC20-001，批准日期2021年3月4日）。根据涉及人类受试者的医学研究的伦理指南，通过选择退出的方式获得了患者的数据使用同意，相关通知发布在诊所的官方网站和内部公告板上。所有程序均符合伦理标准
分裂期胚胎的存活率和临床结果
在分析的150个分裂期胚胎中，各组之间的患者背景没有差异（表2）。所有方案中的卵裂球数量、胚胎等级和玻璃化日期均相似。所有解冻方案在解冻后的存活率为100%，未观察到卵裂球的丢失。在至少2小时的恢复培养期间，每种方案中有相似比例的胚胎继续进行细胞分裂：21.0%（17/81）、15.6%
讨论
本研究提供了全面的证据，证明简化解冻方案不会影响分裂期或囊胚期胚胎的结果。我们的主要发现是，三种不同方案（传统三步解冻方案、中间两步解冻方案和高度简化的一步解冻方案）解冻后的存活率和后续胚胎移植结果相当。值得注意的是，即使在不同的胚胎亚组中，这种等同性也始终得到观察
资金来源
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利部门的任何特定资助。
作者角色
所有作者都参与了研究的构思和设计。材料准备、数据收集和分析由M.S.、M.O.-K.、K.K.、M.F.和K.T.完成。手稿的第一稿由M.S.撰写。所有作者都阅读并批准了最终版本的手稿。
关键信息
无论发育阶段、形态特征或囊胚期如何，简化解冻方案与传统的三步解冻方案对玻璃化人类胚胎同样有效。这些发现支持在试管婴儿实验室中普遍采用高效的一步解冻程序，以减少工作量并缩短胚胎处理时间，同时不损害临床结果。
未引用的参考文献
WF和Fahy，1985年；Chan等人，2025年
致谢
我们衷心感谢高桥妇女诊所的工作人员在整个研究过程中给予的广泛支持。同时，我们也感谢千叶大学医学院妇产科部门在研究中的宝贵合作和贡献。
清谷正博士是高桥妇女诊所的研究主任，同时担任千叶大学医学院妇产科的助理教授。他的研究重点在于优化辅助生殖的效果，包括卵子和胚胎的评估以及胚胎的玻璃化和解冻。
