镉通过PERK-ATF4-CHOP信号通路诱导TM4细胞发生铁死亡

《Reproductive Toxicology》：Cadmium Induced Ferroptosis of TM4 cells through PERK-ATF4-CHOP signaling pathway

　　

宣丽|段娟|魏娇阳|何燕|韩月|周婷|李瑞|张玲|史玉琴

中国武汉科技大学公共卫生学院，湖北省职业危害识别与控制重点实验室

摘要

镉是一种高毒性的重金属，会损害多个器官系统。然而，镉对男性生殖功能的影响尚未完全明了。本研究建立了小鼠睾丸Sertoli细胞（TM4细胞）暴露于镉的模型，以探讨镉对这些细胞铁死亡（ferroptosis）的影响及其潜在机制。实验结果表明，随着毒性物质的增加，细胞存活率、细胞内谷胱甘肽（GSH）含量、线粒体膜电位以及溶质转运蛋白家族7成员11（SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达逐渐下降。相反，内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白78和参与PERK-ATF4-CHOP通路的蛋白质显著上调。PERK抑制剂GSK2656157联合处理显著降低了细胞内氧化应激，提高了GSH水平及SLC7A11、GPX4和核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）的表达，恢复了线粒体膜电位，并下调了PERK-ATF4-CHOP通路中的关键蛋白质。同样，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1联合处理也显著改善了细胞的氧化还原平衡，增加了GSH含量，上调了SLC7A11、GPX4、Nrf2和核心铁死亡调节因子的表达，并有效恢复了线粒体膜电位。因此，我们的研究表明，镉可诱导TM4细胞发生氧化应激，从而激活PERK-ATF4-CHOP信号通路，导致细胞清除氧化应激产物的能力受损，使细胞内脂质过氧化产物大量积累，最终导致TM4细胞发生铁死亡，进而损害男性生殖系统功能。

引言

随着工业化进程的加快，重金属污染已成为环境内分泌干扰物（EDCs）的重要组成部分。工业活动中排放的氧化镉（CdO）、氯化镉（CdCl?）和硫化镉（CdS）等物质不仅造成环境污染，还会通过受污染的食物或空气进入人体[1]。研究表明，镉进入人体后会在大脑、肝脏、肺部、睾丸和血液等器官中积累，对健康造成不可逆的损害[2]、[3]。其中，镉引起的生殖健康问题受到了越来越多的关注[4]、[5]。尽管大量研究揭示了镉对男性生殖毒性的作用机制，但其具体分子机制仍不完全清楚。基于此，本研究旨在从睾丸Sertoli细胞（TM4细胞）的铁死亡角度进一步探讨镉对男性生殖系统的影响及其作用机制。

镉引起的生殖毒性涉及多种机制，包括氧化应激、细胞凋亡以及睾丸组织中类固醇生成的改变，同时直接影响精液质量[6]。这些机制共同损害了男性生殖健康。现有研究表明，镉主要通过体内产生活性氧（ROS）引发氧化损伤[7]，其中内质网应激（ERS）在镉诱导的氧化损伤反应中起关键作用[8]。镉进入细胞后可能破坏内质网（ER）功能并引发ERS[9]，可能激活未折叠蛋白反应通路（如PERK）。在典型的应激反应模型中，该通路通过磷酸化eIF2α并促进ATF4和CHOP的表达来诱导细胞凋亡。

进一步的研究表明，ERS可诱导细胞发生铁死亡[10]。ERS通过激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP等信号通路直接驱动铁死亡，从而上调与脂质过氧化相关的基因并扰乱细胞内铁和脂质代谢[11]。同时，铁死亡过程中产生的大量脂质过氧化物和ROS[12]、[13]会反馈并加剧ERS。ERS会进一步促进ROS的生成[14]，形成相互放大的恶性循环，最终导致细胞死亡。ERS和铁死亡在镉诱导的损伤过程中紧密相关。这一发现为研究镉对男性生殖系统的损害提供了新的靶点。

我们之前的研究表明，镉通过ERS诱导小鼠原始精原细胞发生自噬[15]。虽然ERS与铁死亡之间的调控关系在文献中有详细记载，但其在睾丸支持细胞中的作用仍不完全清楚。Sertoli细胞在维持睾丸功能和精子发生过程中起着关键作用。因此，本研究采用TM4细胞作为研究对象，通过建立暴露于镉毒性的体外 TM4细胞模型，并结合使用PERK特异性抑制剂GSK2656157和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的干预策略，系统研究了镉诱导的支持细胞铁死亡过程中PERK-ATF4-CHOP信号通路的调控机制。

章节摘录

细胞来源与培养

本实验中使用的TM4细胞（源自Sertoli细胞系）购自武汉普赛尔生命科技有限公司。TM4细胞在含有91.5% DMEM/F12基础培养基（Gibco Thermo Fisher Scientific, Inc., USA）、5%马血清（Gibco Thermo Fisher Scientific, Inc., USA）、2.5%胎牛血清（Gibco Thermo Fisher Scientific, Inc., USA）和1%青霉素-链霉素抗生素（Gibco Thermo Fisher Scientific, Inc., USA）的培养基中培养。细胞维持在

CdCl?对TM4细胞存活率的影响

采用CCK-8试剂检测CdCl?处理后的细胞存活率。数据分析（图1）显示，随着CdCl?浓度的增加，TM4细胞的存活率显著下降（P < 0.05），相对于对照组最大下降了70.1%。计算得出CdCl?在TM4细胞中的IC??值为13.3 μM。因此，后续实验使用的镉暴露剂量分别为0、2.5、5和10 μM。

CdCl?对TM4细胞铁死亡相关指标的影响

结果表明，随着镉浓度的增加

讨论

镉污染问题日益严重，其对人类健康的影响不容忽视[20]。国内外研究表明，镉暴露可能导致严重的生殖毒性[8]、[21]。体内和体外研究以及人类流行病学证据均表明，镉会干扰精子发生，降低精液质量，并通过多种病理机制损害内分泌功能[22]。具体而言，它会

结论

我们的研究发现，镉会诱导TM4细胞发生氧化应激，激活PERK-ATF4-CHOP内质网应激通路，导致细胞代谢紊乱。本研究阐明了镉诱导铁死亡的复杂分子机制，为镉的毒性提供了重要的理论见解。

CRediT作者贡献声明

史玉琴：方法学设计、概念构思。段娟：数据可视化、验证。宣丽：初稿撰写、数据整理。何燕：撰写、审稿与编辑、监督。魏娇阳：软件使用、数据分析。周婷：验证、项目管理。韩月：软件使用、数据分析。张玲：项目管理、资金争取。李瑞：监督、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢湖北省自然科学基金（CN）（2018CFB638）、武汉预防医学研究专项（WY22M01）、湖北省公共卫生领军人才项目（2021–73）、湖北省教育厅优秀青年和中青年科研创新团队基金（T2020003）以及“十四五”规划项目的资助，同时也感谢导师的指导和实验室技术人员的协助。