《Resources Chemicals and Materials》：Enhanced production and immunomodulatory properties of lipids from Cryptococcus curvatus, fed-batch bioreactor-cultivated on whey permeate
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微生物生物技术（microbial biotechnology）在开发原料与能源替代来源以及高值化利用工业副产物方面发挥关键作用；此类副产物虽然名义价值较低，但往往含有具有应用潜力的组分。在此背景下，本研究考察了产油酵母（oleaginous yeast）弯曲
微生物生物技术（microbial biotechnology）在开发原料与能源替代来源以及高值化利用工业副产物方面发挥关键作用；此类副产物虽然名义价值较低，但往往含有具有应用潜力的组分。在此背景下，本研究考察了产油酵母（oleaginous yeast）弯曲隐球酵母（Cryptococcus curvatus）ATCC 20509在乳清渗透液上生长并生产具有免疫调节潜力生物产物的能力。该菌株在分批补料生物反应器（fed-batch bioreactor）中采用两种补料策略进行培养：（i）补加浓缩乳糖溶液以诱导脂质积累；（ii）补加浓缩、微滤处理的次级干酪乳清（secondary cheese whey, SCW）。在乳糖补料条件下，该菌株获得了此物种在该类底物上迄今报道的最高干生物量（94.9 g/L）和脂质产量（52.2 g/L）；该微生物脂质产量亦为国际文献所报道最高水平之一。在SCW补料条件下，生物量达到39.1 g/L，且脂质—多糖组成较为均衡，分别为32.1%和34.8%（w/w）。两种条件下所得脂质均富含不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，尤其是油酸，而多糖则含有较高水平的β-葡聚糖。随后，研究人员对第二种分批补料条件所得的全细胞总干生物量、去脂生物量以及提取脂质在PMA诱导分化、LPS刺激的THP-1巨噬细胞中进行了免疫调节活性评价。这是首次评估C. curvatus生物产物作为炎症反应调节因子的研究。结果表明，脂质组分表现出抗炎作用，而去脂生物量消化产物表现出轻度促炎活性。
本文发表于《Resources Chemicals and Materials》，围绕乳品工业高负荷副产物次级干酪乳清（secondary cheese whey, SCW）/乳清渗透液的高值化生物转化展开。研究背景在于，乳清副产物流量巨大、乳糖含量高、污染负荷重，若直接排放将带来显著生态毒性；尽管其已被视为功能性与生物活性成分来源，但全球仍有相当比例未被有效利用。与此同时，微生物油脂（microbial lipids）因可用于生物柴油、功能性油脂替代物等而具有重要应用价值。然而，能够直接利用乳糖并高效积累脂质的产油酵母并不多，弯曲隐球酵母（Cryptococcus curvatus；现多重分类中亦归入Cutaneotrichosporon oleaginosus）是其中代表菌株之一。另一方面，来源于微生物的脂质、多糖尤其酵母β-葡聚糖（β-glucan）的免疫调节潜能日益受到关注，但针对非致病性C. curvatus来源生物产物、尤其是经模拟胃肠消化后材料对标准化炎症细胞模型影响的研究仍明显不足。因此，开展本研究既有助于推动SCW的循环经济利用，也有助于拓展该菌株产物从“油脂生产”向“功能活性材料”方向延伸。
研究人员以C. curvatus ATCC 20509为对象，在1.0 L工作体积分批补料生物反应器中，直接使用经0.22 μm微滤并灭菌的SCW作为培养基，不外加额外营养盐、无机元素或盐类，并在培养过程中无需pH调节。研究设计了两种补料策略：其一为补加浓缩乳糖溶液，以在氮受限条件下强化脂质积累；其二为补加浓缩SCW，以考察在相对营养更充足情境下菌株继续生长及代谢物合成的行为。研究目标不仅包括比较两种策略下菌体、生物油脂和胞内多糖的形成规律，也包括分析脂质组成、β-葡聚糖水平，并进一步评价所得生物产物的免疫调节效应。结果显示，该菌株在两种策略下均能有效利用SCW：乳糖补料模式实现了极高的生物量和脂质产量；SCW补料模式则形成脂质与多糖较均衡的生物质组成。更重要的是，来源于SCW补料体系的脂质组分在THP-1来源巨噬细胞炎症模型中表现出明显抗炎活性，而去脂生物量消化物则呈轻度促炎效应，提示该菌株代谢产物具有差异化的免疫生物学功能。
在技术方法上，研究主要采用以下关键策略：首先，以微滤预处理SCW为单一基础底物，在实验室规模分批补料生物反应器中实施两种脉冲式补料方案，并通过HPLC监测乳糖消耗、茚三酮法测定游离氨基氮（free amino nitrogen, FAN）、重量法测定干生物量与脂质。其次，采用薄层色谱（thin layer chromatography, TLC）与气相色谱（gas chromatography, GC）分析脂质类别及脂肪酸甲酯（fatty acid methyl esters, FAME）组成；通过酸水解比色法测定胞内多糖，并用商业试剂盒定量β-葡聚糖。最后，将全菌体与去脂菌体进行模拟胃肠消化（simulated gastrointestinal digestion, SGID；INFOGEST 2.0），并在PMA诱导、LPS刺激的THP-1巨噬细胞模型中，通过qPCR检测TLR2、TLR4、NFKB1、RELA、IL1B和CXCL8的mRNA表达，以评价免疫调节效应。
3.1. Fed-batch cultures on SCW, pulse-fed with lactose
该部分研究表明，在以浓缩乳糖溶液进行脉冲补料的条件下，C. curvatus ATCC 20509在243 h内累计同化乳糖296.2 g/L、FAN 47 mg/L。补料共进行5次，每当乳糖浓度降至15 g/L或以下时实施。培养初期底物消耗速率最高，在26 h达到2.6 g/L/h。终点残余乳糖为6.7 g/L，残余FAN为14 mg/L，且自培养前25 h后FAN基本维持稳定，说明体系较早进入氮限制状态。该条件下干生物量达到94.9 g/L，脂质含量达55.0%（w/w），对应脂质产量52.2 g/L；胞内多糖为19.8 g/L，占干生物量19.9%（w/w）。动力学上，生物量生产率在早期最高，随后随着脂质积累增强而下降；相反，脂质生产率在55 h后显著升高，并于168 h达到230 mg/L/h。该结果说明，乳糖补料策略成功建立了有利于二级代谢和储存脂质合成的氮限制环境，从而获得极高的油脂积累水平。
3.2. Fed-batch cultures on SCW, pulse-fed with extra SCW
该部分考察了以浓缩、微滤SCW自身进行脉冲补料的培养行为。在48 h内，菌株累计同化乳糖103.3 g/L、FAN 94 mg/L，补料4次；最高底物消耗速率约4.1 g/L/h，出现在14 h与30 h。培养结束时乳糖被完全消耗，残余FAN为37 mg/L，且自36 h后趋于稳定。最终干生物量为39.1 g/L，其中多糖含量为34.8%（w/w，13.6 g/L），脂质含量为32.1%（w/w，12.6 g/L）。与乳糖补料相比，该模式下乳糖向生物量与胞内多糖的转化得率更高，三类产物的生产率亦更高，分别为生物量815 mg/L/h、脂质262 mg/L/h、多糖284 mg/L/h。该结果表明，在相对营养较充足条件下，菌株能够在较短时间内高效形成组成更均衡的功能性生物质，而不仅限于单一高脂积累。
3.3. Lipid analysis and β-glucan content
脂质薄层色谱分析显示，两种培养条件所得总脂质均以三酰基甘油（triacylglycerols, TAG）为主，同时检测到麦角固醇（ergosterol）、游离脂肪酸以及其他中性脂质；极性脂质在SCW补料样品中信号更强。脂肪酸组成分析表明，两种条件下脂质均以油酸为主。乳糖补料条件下，脂肪酸主要为油酸51.4%、棕榈酸23.1%、硬脂酸13.5%、亚油酸10.3%、α-亚麻酸1.4%和肉豆蔻酸0.4%，不饱和脂肪酸占63.0%。SCW补料条件下，油酸为47.0%、棕榈酸29.4%、硬脂酸13.0%、亚油酸9.3%、肉豆蔻酸0.7%、α-亚麻酸0.6%，不饱和脂肪酸占56.9%。说明两类脂质均具有较高不饱和度，且乳糖补料条件下脂质不饱和程度更高。
β-葡聚糖分析进一步显示，乳糖补料条件所得菌体β-葡聚糖含量为11.3%（w/w），占总胞内多糖56.9%，产量10.7 g/L；SCW补料条件下β-葡聚糖含量升至22.6%（w/w），占总胞内多糖65.0%，产量8.8 g/L。两种情况下α-葡聚糖均低于1.8%（w/w）。这一结果表明，SCW补料更有利于形成富β-葡聚糖、高多糖型菌体，而乳糖补料虽单位菌体β-葡聚糖比例较低，但凭借更高总生物量获得了较高的β-葡聚糖总体产量。
3.4. Effect of transcriptional response of bioproducts
为评估免疫调节潜力，研究人员将来源于SCW补料体系的三类样品用于LPS刺激的PMA诱导THP-1巨噬细胞模型：全细胞干生物量消化产物（X）、去脂生物量消化产物（Lf-X）及天然脂质组分（L）。结果显示，Lf-X显著上调TLR2和TLR4表达，且使CXCL8表达高于空白消化对照，提示其具有轻度促炎倾向。相比之下，X与空白消化对照在NFKB1、RELA和IL1B表达上未见显著差异，说明完整菌体基质中不同活性成分可能相互抵消或缓冲。最突出的结果来自脂质组分：L显著下调TLR4、NFKB1、RELA、IL1B和CXCL8相对于LPS对照的表达，显示明确抗炎效应。由此可见，C. curvatus来源不同组分在炎症通路中的作用方向并不相同，其中脂质是主要的抗炎活性承载部分，而非脂质组分则可能触发模式识别受体相关应答。
讨论部分强调，C. curvatus作为可利用乳糖的产油酵母，在SCW等低成本副产物上的培养具有工艺与经济双重优势。本研究在无需高压灭菌、无需额外营养补充和无需pH控制的前提下，完成了SCW向高值微生物产物的高效转化，突出了工业应用潜力。比较两种培养策略可知，乳糖补料更适于在氮限制下追求最高脂质积累和最高总产量，而SCW补料则在较短周期内实现更高生产率及脂质—多糖平衡型生物质生产。文中还将本研究与既往关于C. curvatus或相关分类单元在乳清底物上产脂的国际文献进行了系统对比，指出本研究获得了该物种在乳糖型培养基上迄今最高的生物量和脂质产量之一。与此同时，研究首次量化了该菌株生物量中的β-葡聚糖含量，从而拓展了其作为功能性微生物材料的认识边界。
在免疫调节方面，讨论指出这是首次利用人源THP-1巨噬细胞模型研究C. curvatus胞内代谢产物在炎症条件下的作用。脂质组分可抑制Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）/核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）相关通路关键基因表达，呈现抗炎特征；去脂生物量消化物则对TLR2、TLR4与CXCL8有上调作用，表现轻度促炎效应；完整菌体消化物整体上未显著改变NF-κB信号，提示脂质可能在复杂基质中发挥拮抗或调和作用。作者同时指出，现有结果基于体外模型与基因表达水平，尚不能完全代表体内免疫复杂性，仍需借助更高级体外系统、蛋白质组学、流式细胞术及体内验证进一步阐明作用机制。
研究结论部分可译述如下：过去五十年间，弯曲隐球酵母，尤其是ATCC 20509菌株，因其能够有效代谢乳糖、在SCW上生长并显著积累脂质而受到关注。本研究考察了不同培养策略，证明该菌株具有显著的代谢灵活性和生产能力。研究首次定量了C. curvatus生物量中的β-葡聚糖含量，表明其应用潜力并不限于脂质生产。采用浓缩乳糖溶液脉冲补料时，获得了该物种在乳糖基培养基上迄今最高的生物量和脂质产量。所得富油酸脂质在满足质量与安全标准前提下，可望作为生物柴油原料，或作为食品和化妆品中棕榈油的可持续替代物。相对地，采用浓缩SCW脉冲补料时，得到脂质—多糖组成均衡的生物量，在符合安全要求条件下，适于潜在食品或饲料配方应用。细胞实验表明，C. curvatus代谢产物能够调节THP-1来源巨噬细胞的炎症反应，其中去脂生物量消化物对NF-κB通路的触发方式不同于完整干生物量及其相应脂质组分，而后两者中的脂质部分呈现抗炎活性。总体而言，次级干酪乳清是一种适于利用C. curvatus开发可持续生物过程的低成本底物，可支持具有潜在抗炎特性的脂质生产；该策略为新型营养保健产品（nutraceutical products）的开发提供了路径，同时契合循环经济原则并有助于减轻环境影响。
