综述：调控生死天平：解析癌症治疗中DNA复制应激的导航机制

《Experimental & Molecular Medicine》：Tilting the balance of life and death: navigating DNA replication stress in cancer therapy

　　

基因毒性抗癌疗法通过利用癌细胞增强的DNA复制应激发挥作用。磷脂酰肌醇3激酶相关激酶（PIKK）家族成员，包括共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATR）、共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）和DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs），在停滞和断裂的复制叉处协调DNA损伤反应，触发决定细胞命运的信号级联反应。p53在调控细胞周期、DNA修复和程序性细胞死亡过程中发挥关键作用，尽管p53非依赖性调控机制同样存在。基因毒性药物常诱导治疗诱导衰老，这是一种动态可逆的细胞生长停滞状态，会促进耐药性和不良患者预后。相反，严重的复制应激最终导致DNA复制灾难，表现为不可逆的复制叉崩解伴随大量单链DNA积累，最终引发细胞死亡。因此，DNA复制损伤的严重程度及激活的信号转导通路决定了基因毒性治疗的结局。阐明驱动治疗诱导衰老与细胞死亡的复制应激反应的分子基础，对提升抗癌方案的细胞毒效力具有深远意义。本综述将探讨DNA复制应激反应的机制，重点关注旨在将平衡从生存转向细胞死亡的药理学干预策略。

DNA损伤信号转导

DNA损伤反应（DDR）是一种信号转导过程，细胞通过该过程识别（即检测DNA损伤）、转导（即传递DNA损伤信号）并响应（即决定细胞命运）基因毒性损伤。该反应主要由PIKK家族成员介导的蛋白磷酸化驱动，包括ATM、ATR和DNA-PK（由催化亚基DNA-PKcs和Ku70/80异二聚体组成）。这些激酶共享C端激酶结构域，其两侧分别为上游FRAP-ATM-TRRAP（FAT）结构域和下游FAT C端（FATC）结构域，N端存在可变数量的α-螺线管HEAT重复序列，介导蛋白-蛋白相互作用。DDR激酶的一个关键特征是损伤诱导的S/TQ基序自磷酸化，典型位点包括ATR的Thr1989和ATM的Ser1981，均位于FAT结构域内。DNA-PKcs的自磷酸化位点簇存在于HEAT重复序列中，其中Ser2056和Thr2609最为显著。尽管自磷酸化直接调控DDR激酶活性的功能后果尚未完全明确，但这些修饰被广泛用作基因毒性应激下激酶激活的替代标志物。

一旦启动，ATM-CHK2和ATR-CHK1通路分别构成由双链DNA断裂（DSB）和单链DNA（ssDNA）激活的核心DDR信号级联。效应激酶CHK1和CHK2传递信号以激活细胞周期检查点、DNA修复或凋亡。CHK1对胚胎发育不可或缺，而CHK2在很大程度上是非必需的。尽管生物体可携带ATM或其他DSB修复必需组分的突变存活，但此类缺陷会以基因组不稳定性为代价增加癌症易感性。ATM信号通路无法正常激活与治疗抵抗的发生相关。相比之下，ATR-CHK1轴在激活DNA复制检查点中发挥核心作用，因此对包括癌细胞在内的多种细胞类型的存活至关重要。ATR的基础活性可监测复制蛋白A（RPA）的量，该ssDNA结合蛋白复合物可保护复制叉处的ssDNA，作为限制ssDNA过度暴露和复制叉停滞的监控机制。ATR和CHK1通过抑制周期蛋白依赖性激酶（CDK）介导的磷酸化并阻断CDC45在复制起始点的加载，防止过度的休眠起始点激活。在复制应激下，ATR允许局部休眠起始点激活以促进DNA合成，同时抑制晚复制区域的起始点激活。这种细胞周期与复制叉稳定性的协调确保当DNA复制受损时，细胞不会进入有丝分裂。癌细胞对ATR-CHK1通路的依赖使其成为ATR和CHK1药理抑制的治疗脆弱点。ATM缺失会增加对ATR抑制的敏感性，支持ATM缺陷细胞中DDR信号受损会加剧复制应激并促进复制叉崩解的观点。

DDR激酶的激活模式由DNA底物特异性决定。ATM在响应DSB时的激活需要二聚体向单体转变，并通过与MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物内的NBS1 C端结合实现，该复合物将ATM招募至DNA断裂处并刺激其活性。损伤染色质的H3K9me3组蛋白标记通过招募TIP60/KAT5乙酰转移酶进一步促进ATM激活，后者对FATC基序处的ATM进行乙酰化。ATM也可通过形成二硫键连接的二聚体被氧化应激激活，该过程在低氧条件下独立于MRN发生。相比之下，ATR主要由停滞复制叉处暴露的ssDNA激活，这类ssDNA源于复制解旋酶与聚合酶活性的解偶联或DNA末端的核酸酶加工。ATR通过其伴侣ATRIP被招募至RPA包被的ssDNA。ATR在ssDNA/dsDNA连接处激活，需要其专用激活剂TOPBP1参与，这进一步由TOPBP1与RAD9-RAD1-HUS1（9-1-1）复合物的相互作用介导，后者由RAD17-RFC复合物加载到RPA包被的ssDNA/dsDNA连接处。虽然TOPBP1主要在复制应激期间介导ATR激活，但另一种ATR激活剂ETAA1可直接结合RPA，对未受干扰的S期复制和有丝分裂期间的ATR激活至关重要。通过ETAA1依赖性信号传导，ATR还通过抑制FOXM1依赖性有丝分裂基因网络的转录激活来限制S/G2转换；因此，ATR抑制会导致带有未完成复制DNA的过早有丝分裂进入。

DNA-PKcs具有双重作用，既参与DSB修复，又在复制应激期间调控复制叉动力学。一方面，DNA-PKcs在Ku70/80异二聚体招募后于DSB末端激活，并通过非同源末端连接（NHEJ）启动修复。其催化活性是招募和激活下游NHEJ因子（包括Artemis、XRCC4和DNA连接酶IV）所必需的。另一方面，DNA-PKcs定位于复制叉，并在复制应激期间与ATR信号协同作用。在ATR首先将RPA32的Ser33磷酸化后，DNA-PKcs催化RPA32的Ser4和Ser8后续磷酸化，该事件是S期内检查点激活所必需的。表达Ser4/Ser8磷酸化缺陷型RPA32的细胞表现出检查点激活缺陷、停滞复制叉恢复受损以及同源重组（HR）修复受损，最终导致有丝分裂灾难和细胞死亡。研究还显示DNA-PKcs可在未受干扰的复制叉处与RPA异二聚体形成复合物。重要的是，DNA-PKcs独立于NHEJ促进停滞复制叉重塑，凸显其在复制应激反应中的环境依赖性作用。在中等程度复制损伤条件下，ATR抑制可由DNA-PKcs依赖性CHK1激活补偿以稳定停滞复制叉，进一步强调DNA-PKcs在协调细胞应对DNA复制应激中的作用。

DNA复制应激的新兴来源

随着DNA复制应激持续存在，癌细胞对其复制应激反应的依赖性进一步增强。由于DNA修复能力固有缺失，癌细胞表现出高水平未修复损伤。复制错误和核糖核苷酸的错误掺入也是内源性复制应激的主要来源。异常的DNA二级结构（如DNA核苷酸重复序列和脆性位点形成的发夹结构和G-四链体）会增加复制应激的易感性。复制体与转录机器的碰撞常导致新生mRNA与DNA杂交，形成R-loop。癌基因过度激活会破坏起始点激活并限制可用核苷酸池。许多常规细胞毒性化疗药物会形成DNA加合物、导致链断裂并靶向DNA复制过程。拓扑异构酶活性的抑制会积累复制相关的DSB和DNA-蛋白加合物，最终导致复制叉崩解。

复制相关和复制后ssDNA缺口

聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂（PARPi）可诱导携带BRCA1或BRCA2突变的癌症发生合成致死。经典的以DSB为中心模型提出，PARPi处理的细胞依赖BRCA1/2依赖性HR和停滞复制叉保护来解决源于复制相关单端DSB、PARP在DNA上的捕获以及复制-转录冲突的DNA损伤。然而，更新的证据将ssDNA缺口的积累确定为BRCAness的核心脆弱点，决定了对PARPi的治疗反应。滞后链成熟缺陷和前导链PRIMPOL（引物酶和DNA指导的聚合酶）依赖性重新引发均会导致ssDNA缺口形成。PARP活性构成复制叉后方的一种备用冈崎片段加工通路，用于解决不连续滞后链合成期间形成的ssDNA缺口。这些缺口在BRCA1/2缺陷细胞中与升高的S期特异性PARylation同时积累，且滞后链缺口在该背景下促进复制叉降解。这些细胞还存在ssDNA缺口的复制后修复受损。此外，53BP1缺失赋予的PARPi耐药性可通过删除LIG3逆转，LIG3作用于PARP1依赖的备用冈崎片段成熟通路，从而将BRCAness与滞后链合成缺陷联系起来，并在PARP抑制后导致协同复制叉不稳定。PRIMPOL通过在前导链停滞复制叉的损伤下游重新引发DNA合成产生前导链缺口，该过程在BRCA1/2缺陷细胞中升高。这些缺口可通过跨损伤DNA合成（TLS）填补，在此过程中BRCA1/2限制G2期MRE11介导的缺口扩增。近期研究进一步确定聚合酶θ（POLθ）是复制后缺口填补的介质。POLθ不仅作为HR缺陷下DNA修复的关键备用通路通过替代性末端连接（alt-EJ）发挥作用，还与LIG1和FEN1协同封闭ssDNA缺口，防止MRE11依赖性将这些缺口转化为DSB。MRE11活性还参与BRCA1/2缺陷细胞中ssDNA缺口的产生和扩增。PARPi加速复制叉进程但留下ssDNA缺口，该过程在BRCA1/2缺陷细胞中加剧并导致ssDNA过度积累。此外，PARP捕获可导致ssDNA缺口跨细胞周期持续存在，进而渐进性诱导DSB和复制叉崩解。ssDNA缺口而非DSB是否是治疗反应的主要决定因素仍存在争议。例如，BRCA2^S3214A功能分离突变体研究显示，HR缺失而非ssDNA缺口积累或复制叉去保护驱动肿瘤发生和化疗敏感性。相比之下，RAD51^T131P突变体的研究表明，仅靠DSB修复能力不足以预测PARPi敏感性，该突变以显性负性方式导致新生链过度降解。此外，研究显示获得性治疗抵抗与ssDNA缺口抑制机制更相关，包括受限的复制叉进程、TLS功能获得或RPA对缺口的保护，而HR缺陷或新生链降解与治疗反应无直接关联。许多基因毒性条件不仅对BRCAness细胞致死，对XRCC1缺陷细胞同样致死，而XRCC1在HR中作用甚微但参与单链断裂修复，凸显了未解决缺口产生的基因毒性作为癌症治疗反应决定因素的重要性。由于PARPi处理后ssDNA缺口可在后续细胞周期转化为DSB，这些损伤并非互斥。尽管如此，越来越多的证据表明DSB不一定致死，而严重复制应激下的过度ssDNA缺口积累足以促使细胞走向凋亡。

尿嘧啶诱导的复制应激

胞苷脱氨酶APOBEC家族催化DNA中致突变尿嘧啶的形成，驱动癌症中的C-to-T转换和年龄相关突变特征。5-羟甲基胞嘧啶脱氨基为5-羟甲基尿嘧啶进一步产生致突变U:G错配。掺入新生链的尿嘧啶通过短补丁碱基切除修复（BER）进行复制后修复，由尿嘧啶DNA糖基化酶UNG2或SMUG1启动，随后由APE1切割产生的无嘌呤/无嘧啶（AP）位点。随后的单链断裂由PARP1、XRCC1、Polβ和LIG1识别并解决。相比之下，掺入复制叉附近模板链的尿嘧啶会导致AP位点切割，在缺乏HR修复的情况下产生单端DSB和复制叉崩解。AP位点在复制叉处由HMCES（5-羟甲基胞嘧啶结合，胚胎干细胞特异性）共价结合屏蔽。HR缺陷细胞对5-羟甲基尿嘧啶诱导的HMCES-DNA-蛋白交联特别敏感，会导致复制叉崩解和染色体畸变。类似地，RAD51核丝通过阻止MRE11依赖性切割AP位点来保护复制叉。核苷酸池净化酶DNPH1缺陷导致的5-羟甲基2'-脱氧尿苷5'-单磷酸过度积累，是BRCA缺陷细胞对PARP抑制合成致死的基础。在前导复制叉前方掺入5-氯-2'-脱氧尿苷同样会诱导复制叉崩解和BRCA缺陷背景下的超敏反应。此外，基因组尿嘧啶加工可选择性杀伤BRCA缺陷肿瘤。总之，这些发现确立了基因组尿嘧啶和未解决的BER中间体是复制叉不稳定性和PARPi敏感性的关键决定因素。有趣的是，缺乏UNG2时未处理的基因组尿嘧啶积累会减慢复制叉进程并增强PRIMPOL介导的重新引发，导致ssDNA缺口积累。因此，虽然尿嘧啶损伤可独立于BER被耐受，但与重新引发相关的缺口形成使复制叉易于崩解，除非得到HR、TLS或缺口填补通路的补偿。事实上，APOBEC3B诱导的尿嘧啶积累会促进APE1介导的DNA断裂、PARP1过度激活以及对ATR抑制的敏感性增加，凸显尿嘧啶诱导的复制应激是一种可被治疗利用的脆弱点。

R-loop来源的复制应激——与炎症的联系

R-loop是由RNA-DNA杂合体和一条 displaced DNA链组成的三链核酸结构，是复制与转录机器碰撞产生的复制应激新兴来源。R-loop衍生核酸的异常积累会被模式识别受体感知，触发先天炎症信号通路，进而影响治疗反应。cGAS（环GMP-AMP合酶）-STING（干扰素基因刺激因子）通路尤为相关，该通路检测细胞质核酸以激活干扰素调节因子3（IRF3），并诱导干扰素（IFN）刺激基因和免疫调节细胞因子的表达。I型IFN通过促进CD8+和CD4+ T细胞以及自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性活性来增强抗肿瘤免疫。基于单细胞RNA测序的R-loop评分模型显示，低R-loop负荷与肺腺癌中的T细胞耗竭和治疗效果受损相关。相反，过度R-loop积累和基因组不稳定性会导致慢性炎症并破坏造血稳态，正如骨髓增生异常综合征中所观察到的那样。慢性R-loop驱动的炎症也可能促进免疫抑制性肿瘤微环境，助力免疫逃逸。然而，R-loop与炎症之间的密切联系提供了治疗机会。例如，组成性核因子-κB（NF-κB）激活增强成人T细胞白血病中的R-loop形成，筛选出转录偶联核苷酸切除修复内切核酸酶的缺失。虽然这种适应性使细胞逃避衰老，但也使其对紫外线照射超敏。SMARCAL1（一种SNF2家族DNA转位酶）的缺失通过R-loop积累、cGAS-STING信号激活和PD-L1表达下调增强抗肿瘤免疫，证实R-loop调控可作为癌症免疫治疗靶点。

癌基因诱导的复制应激

癌基因诱导的复制应激是癌症发生和发展过程中基因组不稳定的主要驱动因素。活性癌基因破坏复制保真度和动力学，导致S期特异性DNA损伤积累，触发癌基因诱导衰老（OIS），这是肿瘤发生的固有屏障。相应地，DDR通路被破坏使细胞能够绕过OIS并获得不受限制的增殖能力，推动细胞转化。癌基因诱导的复制应激源于多种机制，但主要与DNA复制动力学改变和细胞周期失调相关。致癌RAS和Cyclin E表达产生独特的DNA脆性景观，常与癌症相关断裂点重叠。这些癌基因通过增加起始点激活和转录促进DNA过度复制，导致复制-转录冲突和R-loop积累。MYC通过失调CDK和E2F表达影响复制起始点活性，在某些条件下减少起始点激活，而过表达时则诱导过度起始点激活。缺陷的核苷酸代谢和升高的活性氧（ROS）进一步促进癌基因相关复制应激。RAS下调核糖核苷酸还原酶亚基M2（RRM2），降低dNTP水平并损害DNA合成。它还通过下调BRIP1损害DSB修复，导致结合伴侣BRCA1从染色质解离。此外，RAS通过促进核心复制体组分TIMELESS（TIM）的降解诱导复制叉不稳定，从而强化OIS。在癌基因激活期间，ROS积累也会加剧TIM从复制体解离。高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是复制应激升高的典型恶性肿瘤，以高拷贝数改变和染色体不稳定性为特征。除BRCA1/2突变导致的常见HR缺陷外，HGSOC的特征是几乎普遍存在的致病性TP53突变和约20%病例中CCNE1（Cyclin E1）扩增。MYC扩增在HGSOC中也普遍存在。Cyclin E1驱动输卵管分泌细胞转化，而输卵管分泌细胞被认为是HGSOC的起源细胞。因此，选择性CDK2抑制通过诱导细胞周期停滞和衰老靶向Cyclin E1过表达的HGSOC，利用癌基因诱导的复制应激进行治疗。

DNA复制应激下的命运决定

生存策略

经历复制应激的细胞会发生衰老，这是一种维持非增殖但代谢活跃表型的细胞周期停滞状态。进行性端粒缩短被视为足以触发复制性衰老并限制基因组不稳定的持续性DNA损伤，而多种内源性基因毒性应激（包括癌基因激活、氧化应激和核苷酸耗竭）会激活信号级联以强制细胞周期退出。这主要由DNA损伤诱导的p53-p21^CDKN1A和有丝分裂应激激活的p16^INK4a-RB通路介导，二者汇聚抑制细胞周期进展所需的CDK。因此衰老作为肿瘤发生的固有屏障，在癌症患者的癌前病变中常可检测到衰老细胞。常规抗癌疗法（包括细胞毒性化疗或放疗）通过激活ATM和ATR通路诱导足以触发衰老的DNA损伤。这种现象被称为治疗诱导衰老（TIS），被认为是通过阻止癌细胞增殖发挥抗肿瘤作用的机制。衰老的一个标志是促炎细胞因子和免疫调节因子的产生和分泌，统称为衰老相关分泌表型（SASP）。关键SASP细胞因子IL-1α通过转录上调IL-6和IL-8促进抗肿瘤免疫，共同增强巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫监视，这在肺癌、肝癌和乳腺癌小鼠模型中已得到证实。虽然恢复p53活性对强化生长停滞和促进免疫清除至关重要，但旁分泌SASP信号传导至周围非衰老肿瘤细胞可进一步抑制肿瘤进展。然而，越来越多的证据表明TIS并非不可逆的命运；相反，持续性TIS使癌细胞能够逃避治疗细胞毒性，并以更高的侵袭性重新填充肿瘤。这并不一定意味着肿瘤细胞实际恢复到衰老前状态；相反，从短暂的“衰老样状态”逃逸伴随着动态的遗传和代谢变化，促成更具恶性的表型。在此过程中，SASP因子通过支持慢性促炎微环境发挥促肿瘤作用，增强肿瘤生长。IL-6介导的髓源性抑制细胞招募通过建立免疫抑制微环境抑制CD8+ T细胞和NK细胞。衰老细胞分泌的基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子促进转移和血管生成。TIS还与干细胞样特性的获得相关，增加了残留细胞重新进入细胞周期的可能性。因此，这些特征使TIS成为肿瘤的生存策略，支持一种瞬时休眠状态，最终促进疾病复发和不良患者预后。NF-κB通路是衰老的主要诱导因子，在基因毒性应激下受ATM直接调控。经典NF-κB信号由炎性刺激激活细胞表面受体启动，导致IκB激酶（IKK）复合物激活，该复合物由两个催化亚基（IKKα和IKKβ）和一个调节亚基NF-κB必需调节因子（NEMO/IKKγ）组成。激活的IKK磷酸化并降解抑制蛋白IκBα，允许NF-κB转位入核并转录诱导促衰老基因。值得注意的是，ATM介导的NEMO翻译后修饰提供了核DDR信号与胞质NF-κB激活之间的关键联系。该过程涉及ATM介导的NEMO Ser85磷酸化，随后Lys277和Lys309发生SUMO化和单泛素化，促进NEMO核输出和下游NF-κB激活。PARP1作为NEMO SUMO化的必需上游调节因子，从而促进ATM依赖性NF-κB信号传导。组成性NF-κB激活见于多种癌症，并与SASP诱导、慢性炎症和治疗抵抗相关。最新证据进一步表明，NF-κB通过促进STING稳定性支持cGAS-STING信号传导，提示NF-κB和cGAS-STING通路可能协同建立TIS，且独立于p53介导的细胞周期停滞。除促进衰老外，NF-κB信号通过诱导促存活基因表达提高凋亡阈值。除了转录上调BCL2L1（BCL-X_L，线粒体凋亡的关键抑制因子）外，NF-κB还诱导抗凋亡效应因子，包括survivin、细胞凋亡抑制剂（cIAP）和X连锁凋亡抑制剂（XIAP），抑制caspase激活。NF-κB还驱动细胞FLICE（FADD样IL-1β转换酶）抑制蛋白（c-FLIP）的表达，该蛋白与caspase-8形成异二聚体并阻止其激活，从而抑制死亡受体介导的和TNFα诱导的凋亡。c-FLIP在癌症中常过表达，是治疗抵抗的关键决定因素。因此，靶向ATM依赖性NF-κB信号可抑制c-FLIP诱导，并通过增强凋亡使结直肠癌细胞对拓扑异构酶抑制剂增敏。AKT激酶也通过磷酸化促凋亡蛋白（如BAD）阻断线粒体凋亡，以及磷酸化凋亡信号调节激酶1（ASK1）阻止c-Jun N端激酶（JNK）激活（否则会在基因毒性应激下促进凋亡）来抑制凋亡。AKT还通过将IKK复合物磷酸化和促进IκB降解进一步促进NF-κB激活。AKT可通过PIKK直接被DNA损伤激活，核AKT增强DDR信号传导和DSB修复。总之，促衰老和促存活通路使癌细胞能够逃避基因毒性治疗，并增加疾病复发风险。

死亡通路

通过调控复制应激信号最大化基因毒性应激可将平衡从生存转向死亡。当复制检查点无法充分对抗复制应激时，细胞会发生DNA复制灾难，其特征是大面积ssDNA暴露耗尽核内RPA池，导致未受保护的ssDNA和复制叉崩解。由过度复制损伤启动的DDR信号可克服TIS施加的凋亡阈值，包括抗凋亡蛋白的高表达。研究人员此前模拟了联合复制体功能障碍和ATR抑制诱导的复制灾难所涉及的p53依赖性信号通路。ATR无法抑制复制体活性和起始点激活，会加剧复制体解偶联引起的ssDNA积累，最终导致凋亡。复制灾难的标志是全核γH2AX，这是致死性复制应激和治疗有效性的生物标志物。该过程由MRE11加工的ssDNA缺口启动，激活涉及DNA-PKcs和CHK1的死亡通路。因此，细胞命运由PIKK的促存活和促死亡功能的转换决定，该功能重编程DDR信号。p53依赖性转录输出的改变是这一转换的核心。p53在Ser15和Ser20磷酸化（稳定蛋白）后，在不可修复损伤条件下进一步在Ser46磷酸化，通过选择性激活促凋亡基因（包括PUMA、NOXA、TP53AIP1和PIG3）启动凋亡p53功能。JNK常被应激刺激共激活，并磷酸化p53以进一步引导其活性走向凋亡。同源盒相互作用蛋白激酶2（HIPK2）与p53AIP1形成复合物，促进p53 Ser46磷酸化；ATM/ATR通过破坏HIPK2与SIAH1泛素E3连接酶的相互作用来稳定HIPK2，这为DDR强度调控p53驱动凋亡提供了机制。在携带p53突变的癌症中，替代死亡通路通常占主导。在过度DNA损伤下，自分泌TNFα-TNFR1正反馈信号促进caspase-8激活，该过程由涉及ATM、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）和NEMO的持续NF-κB活性支持。IL-8分泌进一步促进这一过程，说明炎性信号如何影响DNA损伤后的细胞命运决定。NF-κB-TNFα信号传导期间的RIPK1翻译后修饰调控从caspase-8依赖性凋亡向调节性坏死（即坏死性凋亡）的转换。该通路绕过p53信号传导，并通过诱导MLKL介导的膜透化和渗透性崩解克服抗凋亡屏障（如IAP或c-FLIP）。严重基因组应激和氧化损伤下的过度PARP激活会耗尽细胞NAD+，导致线粒体功能障碍和parthanatos（一种独特的调节性坏死形式）。大量PAR聚合物合成促进凋亡诱导因子的释放和核转位，导致大规模DNA片段化和细胞死亡。有丝分裂失败是p53缺陷癌细胞抵抗基因毒性治疗的延迟细胞死亡反应。有丝分裂灾难源于G1和G2检查点缺陷背景下，不可逆S期DNA损伤后进入有丝分裂，导致染色体错误分离并通过凋亡或坏死发生细胞死亡。该过程常涉及细胞周期监控机制（包括纺锤体组装检查点）失效，导致长期有丝分裂停滞。因此有丝分裂灾难既是抑瘤机制也是治疗脆弱点。HR缺陷癌细胞中的PARP抑制会诱导以染色体桥、滞后染色体和多核化为特征的有丝分裂DNA损伤，导致细胞死亡。MYCN扩增神经母细胞瘤经PARPi治疗后也观察到类似结果。ATR检查点对预防有丝分裂灾难至关重要；相应地，ATR抑制促进CDC7抑制诱导的延迟复制后的过早有丝分裂进入。HR缺陷细胞中ATR和PARP抑制联合可协同驱动有丝分裂失败，凸显了强制灾难性有丝分裂崩解以最大化基因毒性效力和决定癌细胞命运的潜力。

细胞命运决策在癌症治疗中的应用

一-二拳疗法

TIS为通过“一-二拳”策略清除癌细胞提供了独特机会，第一拳通过基因毒性化疗诱导衰老，第二拳利用衰老裂解剂通过凋亡选择性清除这些细胞。临床前模型探索了基因毒性疗法与BH3模拟剂（如navitoclax/ABT-263和venetoclax/ABT-199）的联合，这些药物靶向衰老细胞中常上调的抗凋亡蛋白（如BCL-2、BCL-X_L和BCL-W）。研究显示navitoclax可选择性清除拓扑异构酶抑制剂、吉西他滨和替莫唑胺诱导的衰老细胞，在体外和体内癌症模型中均有效。多项临床前研究在多种细胞系和乳腺癌异种移植小鼠模型中证明，PARPi单药或与放疗联合可诱导衰老，后续使用ABT-263或ABT-199可触发细胞死亡并抑制肿瘤生长。这些发现强调了化疗与衰老裂解剂联合以增强治疗效果并潜在减轻疾病复发和复发的优势。navitoclax已推进多项与基因毒性疗法联合的1期临床试验，包括与奥拉帕尼、依托泊苷/顺铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨和伊立替康的联合。尽管navitoclax联合化疗显示出抗肿瘤活性，但在多项研究中耐受性较差，因血液学毒性导致试验终止，血小板减少和贫血是最常见的不良反应，由靶向BCL-X_L抑制引起。这一毒性在navitoclax和ABT-737的临床前研究中也有观察到。这一挑战推动了选择性BCL-2抑制剂venetoclax的开发，以规避血小板毒性。虽然venetoclax减轻了血液学副作用，但其衰老裂解效力在不同癌症类型中存在差异，推测可能与有效诱导凋亡需要BCL-X_L抑制有关。为克服这些局限，研究人员开发了替代药物递送策略，以选择性靶向衰老细胞同时最小化血小板毒性。一种策略是开发前药Nav-Gal，一种navitoclax-半乳糖偶联物，可被衰老细胞中升高的β-半乳糖苷酶活性特异性切割。另一项研究利用蛋白水解靶向嵌合体技术将navitoclax转化为PZ15227，将BCL-X_L招募至cereblon泛素E3连接酶进行蛋白酶体降解。这些策略为克服基于衰老裂解剂的一-二拳疗法的临床挑战提供了有前景的方向。

PARP抑制剂与DNA复制检查点抑制剂的联合疗法

尽管PARPi已成为生殖系和体细胞BRCA1/2突变癌症的维持疗法，但获得性耐药仍是重大临床挑战。PARPi诱导ATR-CHK1检查点激活，为联合策略克服耐药提供了机会。多项卵巢癌模型的临床前研究表明，ATR或CHK1抑制可使肿瘤对PARPi再增敏，导致DNA损伤增加和细胞死亡。为将PARPi和ATR抑制剂（ATRi）联合治疗作为单一实体递送，研究人员设计了一种双ATR/PARP抑制剂，通过将ceralasertib（AZD6738）与奥拉帕尼化学连接而成。该融合化合物可诱导三阴性乳腺癌（TNBC）细胞G2/M细胞周期停滞并升高γH2AX水平，抑制TNBC异种移植模型中的肿瘤生长。此外，靶向ATR下游信号传导的CHK1抑制剂（CHK1i）SRA737可使PARPi耐药卵巢癌细胞系和患者来源异种移植模型再增敏。基于这些有前景的临床前研究，多项1期和2期临床试验评估了PARPi（如奥拉帕尼、尼拉帕尼、talazoparib和veliparib）与ATRi（如ceralasertib/AZD6738、tuvusertib/M1774、gartisertib/VX-803和berzosertib/VE-822）在实体瘤中的联合应用。这些乳腺癌和卵巢癌试验表明，治疗效果在很大程度上受遗传背景影响。OLAPACO试验（NCT02576444）显示总体客观缓解率（ORR）为8.3%；但ATM突变患者的ORR为20%，且携带BRCA1/2突变并发生获得性PARPi耐药的HGSOC患者ORR为14%。plasmaMATCH试验（NCT03182634）报告胚系或体细胞BRCA1/2突变的TNBC患者ORR为23.1%。2期CAPRI试验（NCT03462342）进一步支持该联合的效用，HR缺陷患者的ORR为50%。类似地，一项联合prexasertib（CHK1i）与奥拉帕尼的1期临床试验（NCT03057145）显示，在获得性PARPi耐药、BRCA缺陷的HGSOC患者中具有抗肿瘤活性和再增敏作用（18例中有4例有效）。这些研究共同凸显了靶向DNA复制检查点以克服PARPi耐药的治疗前景。

PARP抑制剂与免疫检查点阻断（ICB）

PARPi诱导的ssDNA缺口（尤其在BRCA1/2缺陷细胞中）会导致DSB、染色体桥和微核形成。这些未解决的DNA损伤导致DNA和RNA片段泄漏并积聚在细胞质中，激活cGAS-STING通路，并通过增强细胞毒性T细胞浸润刺激抗肿瘤免疫。ICB可通过解除T细胞上的抑制信号进一步增强治疗效果，特别是靶向PD-1/PD-L1。研究还显示PARPi可上调乳腺癌和肺癌细胞系中的PD-L1表达，使其易受PD-1/PD-L1轴破坏的影响。多项临床前研究表明，PARPi与靶向PD-L1（如pembrolizumab和nivolumab）、PD-1（如atezolizumab、durvalumab、avelumab和dostarlimab）或CTLA-4（如ipilimumab和tremelimumab）的ICB联合，在体外和体内模型中诱导协同抗肿瘤活性。早期评估PARPi与ICB联合的临床试验在晚期实体瘤中取得了令人鼓舞的结果。例如，niraparib联合pembrolizumab（NCT02657889）在铂耐药卵巢癌和TNBC中显示出抗肿瘤活性。MEDIOLA试验（NCT02734004）报告了durvalumab联合奥拉帕尼在胚系BRCA1/2突变转移性乳腺癌患者中的良好活性。niraparib联合抗CTLA-4疗法（NCT03404960）在铂敏感胰腺癌中显示出优于nivolumab（抗PD-1）的无进展生存期。这些研究共同凸显了PARPi与ICB联合增强持久应答和克服耐药的潜力。

靶向抗凋亡调节因子与SMAC模拟剂（SM）

SMAC/DIABLO是一种促凋亡线粒体蛋白，释放到细胞质后与IAP结合并降解IAP，从而实现caspase激活和凋亡执行。IAP常在癌症中上调，SM被设计为模拟内源性SMAC蛋白以抵消这种凋亡抵抗。这些药剂可分为单价（如LC161、AT-406/xevinapant/debio 1143和GDC-0152）或二价（如birinapant/TL-32711、HGS-1029和APG-1387/SM-1387），二价化合物通常因多价结合IAP而表现出更强效力。临床前研究表明，SM与化疗药物联合可产生协同细胞死亡。这种协同作用通常需要自分泌TNFα环路通过靶向死亡受体复合物中的cIAP1/2触发外源性凋亡通路。迄今为止，数十项临床试验评估了SM作为单药或与免疫治疗、基因毒性药物和放疗联合的应用。xevinapant联合放化疗治疗头颈部鳞状细胞癌的1期和2期试验（NCT02022098）报告无进展生存期显著改善。然而，后续的3期试验（NCT04459715和NCT05930938）因临床获益不足而终止。同样，多项评估birinapant的2期试验（NCT01681368、NCT02587962和NCT01486784）最终因疗效有限而终止。总体而言，尽管SM被认为是强效的死亡增敏剂，但仍需进一步研究以确定最佳联合伙伴和治疗场景，充分释放其凋亡潜力，同时将毒性和耐药性降至最低。

结论与展望

本综述讨论了癌细胞中复制应激的来源以及决定生存和死亡细胞命运决策的 cellular 反应。ATM、ATR和DNA-PKcs介导的、针对复制损伤的信号转导及其引发的转录程序对肿瘤发生和治疗反应具有深远影响。在基因毒性治疗下，癌细胞常利用TIS作为生存策略，提高凋亡阈值并产生促肿瘤炎性信号。由DDR激酶调控的p53激活程度是通路选择的关键决定因素，而p53非依赖性机制（包括NF-κB和cGAS-STING介导的信号传导）也发挥关键作用。旨在将基因毒性应激最大化至超过生存阈值的策略（如基因毒性疗法与促凋亡衰老裂解剂联合）可能增强抗癌效力，前提是实现了肿瘤选择性增敏同时保护正常组织。解决不同DNA损伤如何在多样遗传背景下转导为特异性复制应激信号，以及识别以癌症特异性方式调控通路选择的