《Nature Communications》：Stress granule phase separation in stress-responsive cytosolic extract-in-oil droplets
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应激颗粒（SGs）是哺乳动物细胞在应对应激时在细胞质中短暂形成的生物分子凝聚体（biomolecular condensates）。其组装或解聚失调与人类衰老相关疾病有关。尽管相分离是SG组装的关键过程，但关于其在生理刺激下的功能、组成和调控仍了解有限。这一知
应激颗粒（SGs）是哺乳动物细胞在应对应激时在细胞质中短暂形成的生物分子凝聚体（biomolecular condensates）。其组装或解聚失调与人类衰老相关疾病有关。尽管相分离是SG组装的关键过程，但关于其在生理刺激下的功能、组成和调控仍了解有限。这一知识空白反映了在单细胞水平上对SG复杂组成的动态调控进行全面和定量研究的挑战。在此，研究人员提出了一种基于乳液微流控的方法来克服这一局限。"胞质提取物油包水滴"（CEODs）重现了一个受限制的活性细胞质环境，在生理条件下对应激产生响应并发生相分离和SG形成。该方法发现了七种先前未被识别的参与信号通路的SG组分。CEODs为未来的机制研究和治疗研究提供了一个多功能且经济高效的筛选平台。
研究背景与问题：应激颗粒（SGs）是细胞在有害条件下于细胞质中短暂形成的生物分子凝聚体，其组装或解聚失调与神经退行性疾病等衰老相关疾病密切相关。SG的形成源于翻译起始抑制的两条途径：一是整合应激反应（ISR）激活后，四种哺乳动物应激激酶（HRI、GCN2、PERK和PKR）磷酸化真核翻译起始因子2α亚基（eIF2α），导致翻译起始停滞和多聚核糖体解聚；二是eIF4F帽结合复合物受干扰，如eIF4A解旋酶被抑制。生物分子凝聚体通过液-液相分离（LLPS）组织，涉及大分子间的弱非共价多价相互作用，由含RNA识别基序和内在无序区域（IDRs）的蛋白质介导。G3BP1和G3BP2是SG凝聚的核心驱动蛋白，与mRNA及SG核心蛋白网络相互作用。尽管SG具有"核心-外壳"亚结构，其动态多价相互作用的精确调控仍不清楚，且SG的RNA和蛋白质组成因应激类型、细胞类型、时间和疾病背景而异。现有自下而上的研究方法（如纯化重组蛋白的体外凝聚）使用非生理参数（高蛋白浓度、高盐浓度、聚乙二醇等拥挤剂），而基于细胞提取物的SG重组系统虽有所改进，仍无法研究细胞对生理应激的反应，因为应激诱导的信号级联调节翻译后修饰（PTMs）并影响SG组装与解聚。
研究内容与结论：研究人员开发了"胞质提取物油包水滴"（CEODs）系统，将翻译活性胞质提取物（CEs）分隔在油包水乳液微滴中，在接近生理条件下重现SG相分离。该系统使用人骨肉瘤U2OS和人肝癌Huh7细胞来源的CEs，验证了其翻译能力、稳定性和均匀性。通过双链RNA（dsRNA）激活PKR介导的ISR，或eIF4A抑制剂（如silvestrol）处理，成功诱导了YFP-G3BP1的相分离，形成类似细胞SG的凝聚体。研究证实G3BP和细胞RNA是CEODs中SG形成的必需支架分子，USP10衍生肽可抑制G3BP1凝聚，且dsRNA和silvestrol诱导的凝聚体在G3BP1动态性上存在差异（silvestrol诱导的凝聚体解聚更慢）。转录组分析显示，翻译抑制诱导的凝聚体RNA组成与砷化物诱导的细胞SG相似，优先富集长转录本。蛋白质组学分析鉴定了七种新的SG客户蛋白：四种E3泛素连接酶（FBXO3、HERC3、TRIM37、TRIM38）、分子伴侣DNAJC6和糖基转移酶MGAT5。其中FBXO3通过调控ITCH表达参与SG解聚的动态调控。该研究发表于《Nature Communications》，为SG机制研究和治疗靶点发现提供了重要的技术平台。
关键技术方法：乳液微流控技术制备CEODs；机械振荡法制备可变大小液滴；双荧光素酶报告基因测定翻译活性；荧光漂白恢复（FRAP）分析蛋白质动态；冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）观察超微结构；多聚腺苷酸mRNA的RNA测序分析转录组；无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量蛋白质组学分析；免疫荧光验证蛋白定位；CRISPR/Cas9基因敲除和siRNA功能筛选。
研究结果：
"翻译活性胞质提取物在水包油液滴中的区室化"：研究人员从U2OS和Huh7细胞制备了具有翻译活性的CEs，通过帽结构多聚腺苷酸尾转录本的荧光素酶报告基因验证了翻译能力。CEs在37°C生理温度下具有活性，与商业化HeLa提取物相当。通过机械振荡将CEs包封在表面活性剂稳定的油包水乳液微滴（CEODs）中，中位直径（25.3±13.1 μm）与细胞相当。评估了CEODs的稳定性、内容物分布均匀性、翻译活性和蛋白质稳定性，证实8小时内条件稳定，且封装过程不影响翻译。
"ISR介导的翻译抑制诱导CEODs中G3BP1相分离"：用dsRNA处理CEs激活PKR-ISR通路，在U2OS CEs和Huh7 CEs中分别使用250 nM和100 nM dsRNA可实现至少50%的翻译抑制，伴随PKR和eIF2α磷酸化增加。YFP-G3BP1 CEODs中，dsRNA处理2小时后形成明亮、球形的G3BP1凝聚体，与PEG诱导的凝聚体机制不同。dsRNA诱导的凝聚体在大小上与细胞SG相当，但圆形度略低。实时成像显示凝聚体在约1小时后形成，与ISR激活的时间动力学一致。PKR敲除或ISRIB（ISR抑制剂）处理可逆转dsRNA诱导的翻译抑制和G3BP1凝聚，证实该过程依赖于ISR。
"CEODs中eIF4A抑制剂处理诱导G3BP1凝聚"：使用eIF4A解旋酶抑制剂silvestrol（2 μg/ml）处理，可在CEODs中诱导ISR非依赖性的YFP-G3BP1凝聚，形成与细胞SG大小和形状可比的凝聚体，证实CEODs适用于研究ISR依赖性和非依赖性的SG相分离。
"CEODs中凝聚需要G3BP和细胞RNA"：在G3BP1/G3BP2双敲除（??G1/2）细胞的CEODs中，dsRNA和silvestrol均无法诱导YFP-TIA1凝聚，而重新表达mCherry-G3BP1可恢复凝聚能力。微球菌核酸酶处理降解内源RNA后，尽管翻译抑制不受影响，但dsRNA、silvestrol和PEG诱导的凝聚均被阻断，证实G3BP和mRNA是CEODs中相分离的必需支架分子。
"USP10肽抑制CEODs中凝聚"：基于USP10通过FGDF基序与G3BP1结合抑制SG形成的机制，添加野生型USP10
8-25肽（1 μM和10 μM）可抑制YFP-G3BP1凝聚，而F10A-F13A突变肽无此效果，表明CEODs可用于筛选SG抑制分子。
"G3BP1在凝聚体中的动态性"：FRAP分析显示，dsRNA诱导凝聚体中mCherry-G3BP1的半恢复时间（t
1/2）为4.8±0.6秒，PEG诱导的为5.7±0.7秒，而silvestrol诱导的显著更慢（99.4±28.3秒），提示不同诱导方式形成的凝聚体具有不同生物物理特性。
"G3BP1相分离引发CEODs超微结构变化"：cryo-SEM显示，与对照相比，dsRNA和silvestrol处理的CEODs呈现薄的蛋白质凝聚片层结构，PEG处理的则更厚，证实翻译抑制导致胞质内容物显著分凝为蛋白质网络。
"SG样凝聚体转录组与细胞SG相似"：RNA测序显示，dsRNA和silvestrol诱导的凝聚体富集了约三分之一的砷化物诱导SGs已知mRNA，且长转录本优先富集；PEG诱导的凝聚体转录组则明显不同。
"SG样凝聚体蛋白质组鉴定新SG客户蛋白"：无标记LC-MS/MS蛋白质组学分析鉴定了dsRNA和silvestrol诱导凝聚体中富集的蛋白质，通过与PEG诱导凝聚体差异分析，发现dsRNA特异性富集线粒体相关蛋白（MGME1、MRRF、NDUFS6、MRPL51），其中MGME1仅定位于dsRNA诱导的细胞SG。此外，鉴定并验证了六种新的SG客户蛋白：E3泛素连接酶FBXO3、HERC3、TRIM37、TRIM38，分子伴侣DNAJC6和糖基转移酶MGAT5。功能研究显示FBXO3缺失加速SG解聚，提示其通过调控ITCH表达参与SG动态平衡。
讨论与结论：研究人员开发了一种独特的应激响应性、翻译活性、细胞大小的CEOD系统，支持ISR依赖性和非依赖性的SG相分离，在接近生理条件下维持细胞信号活性。该系统克服了现有体外方法的局限，具有高通量、低成本、样本量小、检测时间短和适应性强的优势，可用于机制研究和治疗靶点筛选。通过与已发表SG转录组和RNA颗粒数据库的比较，证实CEODs中翻译抑制诱导的凝聚体可视为SG样凝聚体。研究揭示了dsRNA特异性SG组分与线粒体功能的潜在联系，以及四种E3泛素连接酶作为SG客户蛋白参与SG动态调控的新机制，特别是FBXO3-ITCH轴对SG解聚的精细时序控制。这些发现为理解SG在衰老、神经退行性疾病和病毒感染中的病理作用提供了新线索。
论文发表期刊：《Nature Communications》
