《PLOS One》：Differential analysis of Short chain fatty acids incubation in autistic organoids based on transcriptome sequencing
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摘要：自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）以社交沟通困难及受限、重复的行为、兴趣或活动模式为特征。研究人员假设短链脂肪酸（short-chain fatty acid, SCFA）代谢失调可诱导代谢紊乱及促炎反应，共同导
摘要：自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）以社交沟通困难及受限、重复的行为、兴趣或活动模式为特征。研究人员假设短链脂肪酸（short-chain fatty acid, SCFA）代谢失调可诱导代谢紊乱及促炎反应，共同导致幼儿期观察到的社交行为缺陷。本研究通过全转录组高通量RNA测序（RNA-seq）并结合基因本体论（Gene Ontology, GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，分析暴露于不同SCFA的ASD大脑皮层类器官中的全局基因表达差异。ASD大脑类器官分为三组：ASD组（对照）、乙酸钠处理组（Z组）及丁酸钠处理组（J组），每组三个生物学重复。类器官于皮质分化第16至23天分别给予100 μM乙酸钠或100 μM丁酸钠孵育，总时长7天。GO功能注释显示，乙酸盐处理主要改变差异调控相关基因表达，而丁酸盐暴露激活免疫相关过程。KEGG通路分析表明，丁酸盐处理与ASD类器官中TGF-β免疫相关信号通路的富集相关，而乙酸盐处理主要影响转录调控、催化活性及膜通透性（membrane permeability）等分子功能。
基于转录组测序的短链脂肪酸孵育自闭症类脑器官差异分析研究解读
本文发表于《PLOS One》。自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）是一种以社交沟通缺陷及受限重复行为为特征的神经发育疾病，胃肠（gastrointestinal, GI）症状是其常见共病，患者常伴随短链脂肪酸（short-chain fatty acid, SCFA，主要为乙酸acetate、丙酸propionate和丁酸butyrate）谱异常。SCFA由肠道微生物发酵膳食纤维产生，参与能量代谢、肠屏障完整性维持及免疫调节，并可经血脑屏障影响脑功能。虽已有临床研究表明SCFA与ASD存在关联，但SCFA在ASD中的具体作用机制尚不清楚。人源诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的大脑类器官（cerebral organoid）可模拟早期人脑发育，为探究ASD机制提供了有力模型。本研究以ASD来源iPSC衍生的皮质类器官为对象，通过转录组测序分析乙酸钠与丁酸钠处理引起的全局基因表达变化，旨在揭示SCFA在ASD模型中的潜在分子作用机制，为肠-脑轴（gut–brain axis）交互研究提供依据。
主要关键技术方法
研究人员使用来源于ASD患者的iPSC细胞系（GIBHi-001-A）诱导分化为大脑皮层类器官，设未处理ASD对照组、100 μM乙酸钠处理组（Z组）及100 μM丁酸钠处理组（J组），每组各3个生物学重复，于皮质分化第16～23天给药孵育7天（浓度经CCK-8细胞活力实验确定）。提取总RNA构建文库进行Illumina NovaSeq X plus双端150 bp测序，clean reads比对至人参考基因组GRCh38（STAR v2.7.1a），基因表达定量后采用DESeq2进行差异表达分析（阈值|log2倍数变化（fold change, FC）|≥1，错误发现率（false discovery rate, FDR）<0.05），并对差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）行GO及KEGG富集分析（校正p<0.05）。原始测序数据上传至NCBI SRA数据库。
Results（结果）
Selection of SCFA treatment concentrations（SCFA处理浓度的选择）
通过CCK-8法检测不同浓度SCFA下类器官存活率，确定100 μM乙酸钠在测试范围内无显著毒性且维持正常活力；100 μM丁酸钠下细胞活力＞90%，≥200 μM时活力明显下降，故选择100 μM为两组的实验处理浓度。
Sequencing quality control and inter-sample correlation（测序质控与样本间相关性）
9个转录组文库共获得62.49 Gb clean data，各样本clean data＞6.62 Gb，Q30碱基占比95.44%。基于转录每百万（transcripts per million, TPM）值的Spearman相关矩阵及主成分分析（principal component analysis, PCA）显示，ASD组与乙酸钠、丁酸钠处理组转录谱明显分离，PC1解释59.57%总方差，PC2解释19.20%，各组内生物学重复聚集良好，表明处理引起显著的转录水平改变且实验重现性高。
Differential gene expression（差异基因表达）
与ASD对照组相比，丁酸钠处理组（J组）鉴定到6455个DEGs（2711个上调，3744个下调）；乙酸钠处理组（Z组）鉴定到4237个DEGs（1801个上调，2436个下调）。结果表明两种SCFA短期孵育均可诱导ASD类器官广泛的转录重编程。
GO enrichment analysis of DEGs（DEGs的GO富集分析）
丁酸钠处理后DEGs在生物过程（Biological Process, BP）中显著富集于免疫系统过程、生物调控及代谢过程；细胞组分（Cellular Component, CC）富集于细胞器及细胞成分类别；分子功能（Molecular Function, MF）富集于催化活性、转录调节活性及结合功能，提示丁酸对ASD类器官免疫相关程序有显著影响。乙酸钠处理后DEGs主要富集于MF中与分子功能调控、转录调控、催化活性及膜通透性相关的条目；CC关联膜及胞外/膜性组分；BP涉及多细胞生物过程、细胞定位及细胞组分组织。
KEGG pathway enrichment analysis（KEGG通路富集分析）
丁酸钠处理组DEGs显著富集TGF-β信号通路、癌症中非编码RNA、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、蛋白质消化吸收、MAPK信号通路及Hippo信号通路等。乙酸钠处理组DEGs显著富集轴突导向（axon guidance）、钙信号通路、细胞黏附分子（cell adhesion molecule, CAM）、Ras信号通路、基底细胞癌、MAPK信号通路、干细胞多能性调控通路、神经活性配体-受体相互作用、致心律失常性右室心肌病、癌症通路、蛋白质消化吸收及PI3K–Akt信号通路。
Discussion（讨论总结）及Conclusion（结论翻译）
讨论部分指出，既往SCFA与ASD研究多为临床观察，本工作以ASD来源脑类器官结合转录组分析初步揭示SCFA潜在分子靶点。丁酸处理上调TGF-β信号通路，而TGF-β参与免疫稳态、神经元发育及突触可塑性，且该通路异常与ASD病理生理相关，提示丁酸可能通过免疫调节影响ASD相关通路，但因未设置健康对照类器官，无法判定此响应是否为ASD特异性。乙酸盐处理主要改变细胞通透性及膜相关过程基因，可能与SCFA调节上皮屏障功能一致，同样需健康对照验证。作者承认脑类器官缺乏血管及免疫细胞（如小胶质细胞microglia），限制了对神经炎症及肠-脑轴的完全模拟，且7天短期暴露未能捕获长期适应反应，后续需在含健康对照、更长时程、更复杂模型（assembloid或体内）中验证。
结论翻译如下：
综上所述，本转录组测序研究表征了ASD来源大脑类器官暴露于乙酸盐或丁酸盐后的全局基因表达变化。丁酸盐处理与TGF-β信号通路富集相关，而乙酸盐处理主要影响细胞通透性（cellular permeability）及膜功能相关基因。这些发现确定了SCFA在ASD模型系统中可能作用的候选分子通路。然而，由于缺少健康对照类器官，现有数据尚不能得出ASD特异性效应或治疗潜力的结论。未来需纳入对照类器官及体内模型来验证上述观察，并确定所鉴定通路是否代表疾病相关机制。
