通过单细胞(scRNA-seq)分析鉴定糖尿病与心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)患者非心肌细胞(non-cardiomyocytes)的标志基因

《PLOS One》：Identification of non-cardiomyocytes marker genes in patients with diabetes and cardiomyopathy through single-cell analysis

　　

背景：糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由糖尿病引起的与缺血、高血压无关的心肌疾病，表现为纤维化、肥大及舒张/收缩功能不全。本研究旨在探讨非心肌细胞(non-cardiomyocytes)中的代谢、炎症及纤维化机制在DCM中的作用，以揭示新的治疗靶点。方法：采用单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)研究DCM中非心肌细胞的作用，鉴定细胞类型、基因表达动态及2型糖尿病患者细胞间通讯网络；数据取自基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)；使用scMetabolism计算代谢通路得分；进行细胞轨迹分析(cell trajectory analysis)及细胞通讯分析；采用CCK-8、克隆形成、Transwell迁移及侵袭实验探究PTPRC在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)中的功能。结果：研究人员通过SingleR注释鉴定出8种细胞类型，自然杀伤(natural killer, NK)细胞和平滑肌细胞(smooth muscle cells)为两疾病共有细胞群；细胞轨迹分析揭示基于拟时(pseudotime)基因表达的三条分支，各细胞类型差异表达基因(top differentially expressed genes)聚为六类；代谢通路分析预测上皮细胞、巨噬细胞及神经元代谢最活跃，体现代谢异质性；预测与NK细胞和平滑肌细胞相关的四条关键信号通路，强调细胞间基因表达差异；PTPRC参与糖尿病与心肌病发病，且是HUVEC活力、克隆生长、迁移及侵袭的正调控因子。结论：本研究证明糖尿病与心肌病患者非心肌细胞存在显著异质性，需针对这些差异进行靶向治疗干预。

论文解读：通过单细胞分析鉴定糖尿病与心肌病患者非心肌细胞的标志基因

本文发表于《PLOS One》。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病严重并发症，特征为无缺血性心脏病及高血压情况下的心肌结构与功能异常，其发病机制涉及心肌代谢障碍、间质纤维化、氧化应激及炎症反应等。目前关于非心肌细胞(non-cardiomyocytes, 如免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞)在DCM中介导代谢、炎症及纤维化机制的研究尚不充分，且人类DCM单细胞(scRNA-seq)样本稀缺。为此，研究人员整合公共数据库中部2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)胰岛及心脏病（冠心病与扩张型心肌病）心脏组织的scRNA-seq数据，探索非心肌细胞类型特异性贡献、异质性及细胞间通讯，旨在识别潜在治疗靶点。

主要关键技术方法

研究人员从GEO获取人T2DM胰岛(GSE153855, n=5)及心脏病心脏组织(GSE121893, n=8)的scRNA-seq数据。使用Seurat进行质控（滤除线粒体>10%细胞及DoubletFinder去除双细胞）、SCTransform归一化及整合；选用SingleR包（参考HumanPrimaryCellAtlas）进行细胞注释，FindAllMarkers鉴定差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)；Monocle2进行拟时(pseudotime)轨迹及分支表达分析建模(branched expression analysis modeling, BEAM)；scMetabolism（KEGG通路,VISION法）量化单细胞代谢活性；CellChat分析细胞-细胞通讯(cell-cell communication)，含配体-受体(ligand-receptor, L-R)对推断及信号通路强度计算；体外采用shRNA敲低及过表达PTPRC(CD45)，通过CCK-8、克隆形成及Transwell实验验证HUVEC功能。

研究结果

Reduction and Clustering（降维与聚类）

研究人员整合数据后获得28,829个细胞，经SingleR注释为8种细胞类型（平滑肌细胞、NK细胞、内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、神经元、组织干细胞），经经典标记基因验证。平滑肌细胞和NK细胞为糖尿病与心肌病共有细胞类型。提取各细胞类型top 3标志基因绘制点图与热图，基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)显示花生四烯酸代谢等Hallmark通路显著富集。

Cell Trajectory Analysis（细胞轨迹分析）

Monocle2拟时分析识别出三条分支，轨迹起点多为心脏组织细胞，分支2、3胰岛细胞比例增高。巨噬细胞仅出现在轨迹末端（终末分化态），单核细胞仅见于分支1（早期阶段）。BEAM分析将top标记基因按拟时表达变化聚为6簇，显示不同细胞类型沿发育轨迹的分化及基因表达动态。

Quantify Metabolism Activity at Single-Cell Level（单细胞水平代谢活性定量）

scMetabolism分析显示上皮细胞、巨噬细胞、神经元及组织干细胞在多代谢通路中评分较高；内皮细胞与单核细胞在氮代谢通路富集。心脏组织主要富集新霉素/卡那霉素/庆大霉素生物合成、苯丙氨酸代谢及细胞色素P450药物代谢通路，胰岛组织代谢模式样本间存在差异。

Cell-Cell Interaction Analysis（细胞互作分析）

CellChat推断上皮细胞?巨噬细胞、上皮细胞?神经元、平滑肌细胞?巨噬细胞互作数量最多。NK细胞仅接收巨噬细胞GALECTIN信号并向巨噬细胞发送信号。提取共有细胞群（NK细胞、平滑肌细胞）重新分析代谢，发现两者代谢谱不同——心脏组织中氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)为主，胰岛组织代谢异质性持续存在。

Visualization of Inferred Signaling Networks Involving NK Cells（涉及NK细胞的推断信号网络可视化）

研究人员聚焦NK细胞与平滑肌细胞相关信号通路：GALECTIN通路中巨噬细胞向NK细胞发送LGALS9-CD45(LGALS9-PTPRC)等配体-受体对；GDF通路中上皮细胞同时靶向NK与平滑肌细胞，后者互作更强；MK通路中神经元向各细胞发信号，神经元→NK强于神经元→平滑肌；SPP1通路中上皮细胞和巨噬细胞均与NK及平滑肌细胞互作。

NK Cell-Related Signaling Networks and L-R Pair Contributions（NK细胞相关信号网络及L-R对贡献）

GALECTIN通路主要L-R对为LGALS9-CD44 > LGALS9-PTPRC(CD45) > LGALS9-HAVCR2；GDF通路为GDF15-TGFBR2 > GDF11-(TGFBR1+ACVR2A)；MK通路MDK-NCL贡献最大；SPP1通路SPP1-CD44与SPP1-(ITGAV+ITGB1)贡献相当。PTPRC与CD44在NK细胞中高表达。

Expression of Signaling Genes Across Cell Types and Heatmap of Signaling Strength（信号基因跨细胞类型表达及信号强度热图）

PTPRC(CD45)和CD44在NK细胞中高表达；NCL在NK与平滑肌均高；ITGB1在平滑肌更高；TGFBR2在两细胞中相对高表达但整体偏低。信号强度热图显示NK细胞在CCL通路具强传出信号，传入信号弱；平滑肌细胞参与多条传出(COMPLEMENT, CHEMERIN, PTN)及传入通路。非负矩阵分解(non-negative matrix factorization, NMF)将细胞通讯模式分为3种传出、7种传入模式，NK与单核细胞归为同一模式。

PTPRC Overexpression Increases Cell Viability, Colony Formation, Migration and Invasion（PTPRC过表达增强细胞活力、克隆形成、迁移及侵袭能力）

体外实验证实：shPTPRC敲低降低HUVEC中PTPRC mRNA及蛋白水平，过表达反之。功能实验表明PTPRC敲低抑制HUVEC活力、克隆形成、迁移及侵袭；PTPRC过表达促进上述表型，提示PTPRC是HUVEC生物学功能的正调控因子。

讨论与结论

研究人员指出本研究整合胰腺胰岛与心脏组织数据可能引入组织特异性转录偏差，共有细胞群需进一步用确诊DCM人心脏组织验证。NK细胞与巨噬细胞在多信号通路中间接提示其在DCM中潜在作用；代谢分区显示NK细胞富集糖酵解与OXPHOS，平滑肌细胞富集脂肪酸与氨基糖代谢，可能参与DCM进展恶性循环。PTPRC(CD45)作为造血细胞表达蛋白酪氨酸磷酸酶，既往报道与心肌病、心肌纤维化相关，本研究提示其为糖尿病与心肌病潜在的干预靶点，但HUVEC实验为间接佐证，需在原代心脏内皮细胞/NK细胞及体内模型中确认。

结论翻译：综上所述，本研究整合糖尿病与心肌病患者的scRNA-seq数据，探索共有细胞群及跨组织异质性。基于拟时分析将基因按动态表达模式分为六簇。NK细胞与平滑肌细胞被鉴定为两疾病共有主要细胞群，预测了涉及这些细胞的数条信号通路（相关基因需进一步实验验证）。PTPRC可作为糖尿病与心肌病背景下值得深入研究的潜在治疗靶点。