《Current Opinion in Biotechnology》：Bacteriophage nanoparticles: an emerging modular delivery platform
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纳米颗粒现已成为多种药物与疫苗递送策略的核心，但多数纳米颗粒需针对每种应用重新配制。噬菌体衍生纳米颗粒提供了一种基因编码、结构明确且模块化的替代方案。该综述将近期进展沿三条可调节轴线——支架、表面与货物——进行梳理，并重点介绍噬菌体-聚合物/脂质/无机杂化构建
纳米颗粒现已成为多种药物与疫苗递送策略的核心，但多数纳米颗粒需针对每种应用重新配制。噬菌体衍生纳米颗粒提供了一种基因编码、结构明确且模块化的替代方案。该综述将近期进展沿三条可调节轴线——支架、表面与货物——进行梳理，并重点介绍噬菌体-聚合物/脂质/无机杂化构建物在拓展稳定性、靶向性和装载能力方面的进展。研究人员综述了从多价疫苗、超大基因转移到精准微生物组编辑等领域的应用，并概述了转化障碍。噬菌体衍生产品正逐步走向转化，其中基于病毒样颗粒（VLPs）的疫苗和CRISPR增强型抗菌噬菌体已进入临床试验阶段。最后，该综述展望了新兴机遇，包括人工智能（AI）引导的衣壳与受体结合蛋白设计、无细胞噬菌体合成，以及可与传统纳米颗粒联用的标准化"参考"噬菌体底盘，这将使噬菌体纳米颗粒成为可重复使用的即插即用型纳米药物。
**工程模块化噬菌体平台**
噬菌体纳米颗粒作为模块化纳米载体平台的开发，围绕支架、表面和货物三个相互关联的层次展开，可通过遗传学、物理化学和杂化策略进行工程化改造（图2）。
**支架**
支架层面的模块化指在不重建整个平台的前提下，对噬菌体纳米颗粒的物理底盘进行重新工程化。研究人员通过自上而下地互换或突变噬菌体基因组中的衣壳基因，以实现衣壳蛋白的期望改变。现有多种方法可用于衣壳蛋白的改造，这些工具已被用于调节衣壳稳定性、表面电荷、靶向性以及部分噬菌体的整体颗粒尺寸，同时保持有效的自组装能力。例如，将大肠杆菌PhoE信号肽插入噬菌体衣壳基因，使其在生产过程中自然包被脂质，从而增强口服给药的酸稳定性；通过理性设计和适应性实验室进化优化衣壳蛋白序列，也可提高噬菌体的热稳定性（>60℃）和环境离子浓度耐受性。此类支架修饰具有明确的功能意义：增强的稳定性可延长保质期并提高对制剂压力的抵抗，而改变的电荷和疏水性则可调控聚集行为和循环时间。
为最大化货物容纳空间，研究人员现采用病毒样颗粒（VLPs）、噬菌粒（phagemids）和体外组装系统生产去除天然病毒基因组的"空"衣壳。这些最小化底盘保留结构完整性，但提供可包装核酸或蛋白质的中空外壳。近期基于T4噬菌体的工作已利用体外系统将靶向蛋白与非噬菌体核酸包装入预组装的衣壳头部。此外，黏粒（cosmids）和噬菌粒作为自复制DNA构建体，编码噬菌体结构和包装蛋白用于体内衣壳生产，但缺乏将自身包装入衣壳的必需位点，从而使衣壳得以携带其他核酸货物。
**表面**
表面层面的模块化指在不改变底层颗粒架构或货物的前提下，重编程纳米颗粒与环境界面的能力。噬菌体纳米颗粒在此领域具有优势，因其成功繁殖要求表面必须具有高度可塑性以应对宿主进化对受体的遮蔽。这种灵活性对纳米载体至关重要，因为表面特征决定颗粒与生物系统的相互作用，影响靶向性、摄取、免疫识别和清除。
噬菌体展示技术正是利用噬菌体在表面高效呈现多样蛋白结构的固有能力，已成为发现高亲和力配体的成功方法（框1）。表面修饰可通过浓缩靶组织摄取、减少脱靶沉积、实现更低剂量下的治疗效果来优化性能。此外，尾纤维、尾钉或领圈蛋白等宿主识别结构的可分离特性，使其可被互换或修饰以重定向至新受体，包括用于HIV和癌症治疗的哺乳动物细胞表面标志物。噬菌体纳米颗粒的优势在于靶向配体可直接编码于噬菌体基因组中，并在噬菌体产生病毒粒子时自动附着。
成熟噬菌体病毒粒子的表面还可通过化学酶促反应进行产后修饰，赋予其遗传编码难以实现的增强靶向性。已开发多种此类系统，包括分选酶（sortase）介导的与表面暴露LPXTG基序的偶联，以及SpyTag-SpyCatcher系统——在带有SpyCatcher结构域的表面蛋白与携带13个氨基酸SpyTag肽的外源蛋白之间形成高度特异性共价键。在实际应用中，单一噬菌体支架可通过简单改变表面配体重定向至新细胞类型或疾病位点，而核心颗粒设计、生产工艺和货物装载策略保持不变。
噬菌体基纳米颗粒也可通过与聚合物或脂质结合来增强功能，类似于无机纳米颗粒的修饰方式。在这些构建物中，噬菌体颗粒作为基因可编程核心，而添加的合成组分贡献蛋白质难以单独实现的特性。聚合物层可调节表面电荷、空间位阻特征和胶体稳定性，或引入酸、还原或酶活性环境下触发货物释放的刺激响应性连接子。噬菌体颗粒甚至可被磁力引导至靶部位。
**货物**
噬菌体纳米颗粒平台主要开发用于携带多样核酸和蛋白质载荷，仅需微小设计改动且不破坏底层颗粒。除靶向功能外，衣壳蛋白的表面暴露区域可用于展示一系列化学物和蛋白质。例如，T4噬菌体外衣壳蛋白Hoc（高免疫原性外衣壳）和Soc（小外衣壳）已被用于展示五种不同的SARS-CoV-2和流感抗原以创建多价黏膜疫苗；成像剂和近红外控制杀伤邻近病原菌的金纳米棒也可通过产后组装方式附着。特别是遗传密码扩展工程，通过工程化噬菌体掺入具有生物偶联手柄或荧光特性的非天然氨基酸，极大拓展了噬菌体纳米颗粒的应用潜力。
噬菌体纳米颗粒在哺乳动物细胞大DNA货物递送方面具有优势地位。与常用的腺相关病毒（AAV）和慢病毒哺乳动物载体相比，噬菌体可递送显著更多的DNA：T4噬菌体名义上包装约171 kb双链DNA，而AAV仅约5 kb、慢病毒约9 kb。工程化T4噬菌体已成功将完整的抗肌萎缩蛋白基因（11 kb）递送至培养的人细胞，此前这一任务只能通过三AAV同时递加后体内重组实现。该T4系统还同时向同一细胞递送蛋白质、DNA和RNA。结合噬菌体和AAV优势的杂合载体也已实现，证明可在啮齿动物模型中向人肿瘤异种移植物进行体内核酸载荷递送。噬菌体生产也较AAV或慢病毒更简单廉价，尽管其生产方案和基础设施仍在发展中。
噬菌体也是向细菌递送合成遗传载荷以原位检测、修饰或根除的天然选择。噬菌体疗法最常见的临床应用是治疗抗生素耐药感染，经验表明其对人类安全，因此噬菌体基纳米颗粒的人用应用已受益于这一安全记录。在微生物组中，工程化噬菌体正被部署以精准编辑细菌群。近期研究展示了从选择性细菌耗竭到靶向基因编辑和原位治疗载荷表达的干预谱系，包括CRISPR-Cas介导的特定大肠杆菌菌株消除、碱基编辑器驱动的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌肠道抗生素耐药基因破坏，以及噬菌体介导的丝氨酸蛋白酶抑制剂生产用于溃疡性结肠炎模型治疗。其他策略还包括工程化噬菌体表达异源抗菌效应物如细菌素和细胞壁水解酶以增强噬菌体疗法效果。
噬菌体基纳米载体研究的关键空白在于缺乏非核酸货物包装的定量测量，特别是小分子。尽管Ashley等已证明MS2 VLP的此类测量可行，但其他噬菌体平台尚未得到系统研究。非噬菌体衣壳系统（如封装蛋白）的研究为噬菌体衣壳工程向此方向发展提供了有用先例。关键开放问题在于，衣壳的靶向遗传修饰是否可用于促进更高效的小分子体外装载和更可靠的体内释放。为与其他纳米载体（如树枝状大分子或外泌体）竞争，噬菌体基纳米载体需要允许在衣壳内部而非外部装载相对较高量的强效小分子药物，因为外部货物更易受环境降解或非特异性蛋白相互作用影响。除装载效率外，还需更深入理解药物释放机制，特别是如何在不损害结构完整性的前提下，利用切割型连接子策略调控衣壳通透性。
**转化考量**
对于工程化噬菌体纳米颗粒，最大挑战并非实验室中可构建什么，而是什么可在患者体内有效递送且可规模化。使噬菌体成为有吸引力模块化支架的相同特性——免疫原性、遗传可塑性和细菌的廉价生产——也可能限制其在患者中的有效使用。
噬菌体免疫原性因类型和背景而异。虽有抗噬菌体抗体高流行率的报道，但临床效应高度可变。许多衣壳可激发强烈的抗体和细胞因子反应——这对疫苗设计是优势——但其他衣壳显示中等免疫原性，而隐形涂层或VLP衍生物等策略可进一步降低非疫苗治疗应用的免疫激活。
除安全性外，纳米载体必须证明良好的生物分布和药代动力学，需有靶组织积累、肿瘤渗透、清除途径以及与血液成分和微生物组相互作用的定量证据支持。天然噬菌体和噬菌体基纳米载体已通过多种途径给药，包括静脉全身给药、口服、吸入和局部应用。与其他纳米颗粒不同，噬菌体基纳米载体具有在合适细菌宿主存在时自然扩增的能力，但也可轻易设计为仅作为复制缺陷型颗粒以防止不可控扩散。噬菌体稳定性高度依赖于噬菌体类型与给药途径的相互作用，例如部分噬菌体耐酸故更适合口服给药，而另一些则耐受雾化过程中的剪切力。
平台成功的关键在于生产和监管可行性。高产低成本细菌生产必须配合 robust 内毒素去除，以及对衣壳完整性、货物装载和表面修饰的一致控制。杂化噬菌体-聚合物、-脂质或-无机构建物可改善稳定性、靶向性和成像能力，但也会使表征和监管审查复杂化。最有可能从实验系统进展为实用纳米药物的噬菌体纳米载体，将是那些将模块化设计与简单、可重复生产和明确安全性特征相结合的平台。
**结论与展望**
噬菌体纳米颗粒位于生物学与材料科学的有益交叉点。其紧凑、注释良好的基因组和稳健的衣壳耐受广泛的遗传和化学修饰，使支架、表面和货物均可被模块化调节。
计算工具和合成生物学的新进展正加速这些多功能平台的设计和应用。深度学习模型如AlphaFold2和ESMFold已用于从多样噬菌体群生成高质量受体结合蛋白结构预测文库，可用于工程化具有新结合特性的噬菌体纳米颗粒。结合高通量功能筛选与宏基因组和结构信息库的新方法，有望快速提高噬菌体衣壳工程效率。生成式语言模型最近设计了可存活且独特的phiX174样噬菌体基因组，标志着向完全从头噬菌体设计的迈进。
为充分利用这些计算进展，该领域可能需要超越生物宿主的限制。无细胞噬菌体复制系统可通过将设计与活力解耦来提供解决方案，不仅能加速噬菌体设计-构建-测试周期，还能仅优化用于向人细胞递送遗传载荷的非感染性噬菌体合成。更系统的体内研究必须将特定设计选择与生物分布、免疫反应和长期安全性联系起来，特别是对杂化构建物中附加材料与底层衣壳的相互作用。同时需要可扩展的标准化生产流程和分析检测方法，使相关噬菌体产品家族可被监管机构一致评估。未来工作应聚焦于开发为安全性和生产性优化的"参考"噬菌体底盘，靶向配体和货物可以即插即用方式互换。通过在噬菌体自然具有优势的领域（如多价疫苗或超大基因递送）验证这些模块化平台，噬菌体纳米颗粒可成熟为一类稳健的模块化纳米药物。
