《Engineering Microbiology》：Exploring the emerging role of CRISPR-Cas systems in probiotic development
通过有益微生物对肠道微生物群（gut microbiota）进行调控可延长机体寿命，由此催生了益生菌这一概念。益生菌是指在足量摄入时可赋予宿主健康获益的活性微生物。由于其显著的健康促进作用，益生菌领域迅速扩展，并在新应用开发方面受到广泛关注。当前，利用遗传修饰开展微生物应用探索已成为研究热点。基于成簇规律间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）-Cas系统的基因工程技术因其成熟应用而受到高度重视。凭借其增强特性，CRISPR-Cas系统现已广泛应用于医学、农业、食品及生物技术等领域。鉴于该系统源于细菌的适应性免疫系统，这一遗传工具可用于改造微生物基因组。乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）因其益生潜力而获得广泛认可，且超过40%的LAB物种含有CRISPR-Cas系统。随着益生菌需求的持续增长及其应用范围的不断扩大，提升其既有特性已成为必要。CRISPR-Cas系统因其精确性、准确性与快速性，使研究人员得以对益生菌基因组进行修饰，从而增强其有益属性。该系统可通过添加型、减除型或调节型机制提升益生菌特性。当前，研究人员已开发出多种利用CRISPR-Cas系统改善益生菌功能的方法，例如以高效启动子替代低效启动子、去除不良组分、增强代谢能力以及提高耐受水平。此外，经CRISPR工程化的益生菌已发展为具有增强性状与先进应用前景的下一代益生菌，并在食品、医学、农业及制药等多个领域展现出广泛应用价值。
1. Introduction
论文首先从生命科学领域常用遗传工具切入，指出基因工程技术已广泛服务于疾病治疗、能源生产、公共卫生与微生物功能增强等方向，其中微生物因代谢灵活、增殖迅速而成为基因编辑的重要对象。文中比较了锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）与成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）-Cas系统，强调CRISPR-Cas因设计简便、效率高、重复性好及成本较低而成为当前分子生物学的重要标准工具。文章进一步说明，该系统通过单导向RNA（single guide RNA, sgRNA）引导Cas9对特定DNA序列进行识别与切割，从而实现靶向遗传改造。随后，作者将讨论重心转向人体微生物组与益生菌，指出CRISPR技术可对微生物进行添加型、减除型和调节型操作，以增强有益功能、移除不良遗传成分或重塑现有微生物功能。基于益生菌应用不断扩展、传统菌株性能存在局限这一背景，文章提出CRISPR-Cas系统可望推动更高效、更稳定、功能更广的工程化益生菌及下一代益生菌开发，并明确本综述旨在系统总结CRISPR技术在益生菌精准改造、功能提升和治疗潜力增强中的研究进展。
2. Overview of probiotics
本节回顾了益生菌概念的形成与演变。文章指出，益生菌理念可追溯至Elie Metchnikoff关于发酵食品摄入与长寿相关性的观察，之后“probiotic”一词在1965年被提出，并经世界卫生组织及国际益生菌与益生元科学协会（ISAPP）逐步规范为“足量给予宿主后带来健康获益的活性微生物”。在菌种层面，已有多个属被认定具有益生潜力，包括Lactobacillus、Bifidobacterium、Enterococcus、Streptococcus、Escherichia coli、Bacillus和Saccharomyces，其中Lactobacillus和Bifidobacterium研究最为广泛，并具有一般公认安全（generally recognized as safe, GRAS）和安全性合格推定（qualified presumption of safety, QPS）地位。文章概述了益生菌的核心功能，包括增强先天性和适应性免疫、抵御感染、辅助疾病防治、恢复肠道微生态以及改善食品营养、功能和感官品质，同时还可产生后生元（postbiotics）等有价值代谢产物。作者进一步指出，优良益生菌的筛选需综合考虑菌株鉴定准确性、安全性、抗生素耐药与毒力特征缺失、耐酸耐胆盐能力、黏附聚集性能、加工存活性及功能代谢能力等多重标准。然而，目前尚无单一菌株同时具备理想的功能、安全与工艺学特征，导致商业菌株与研究中描述菌株之间存在明显差距。基于这一现实，文章认为CRISPR基础工程改造为补足功能缺口、去除不良性状并优化代谢路径提供了重要解决方案。
3. Introduction to the CRISPR-Cas system
该部分系统介绍了CRISPR-Cas系统的定义、组成、分类和作用机制。文章指出，CRISPR最初被发现为约30–40 bp的短重复序列，后被界定为细菌和古菌抵御病毒及移动遗传元件的适应性免疫防御系统。其结构由CRISPR阵列与Cas蛋白共同构成：前者储存外源入侵者的“遗传记忆”，后者负责识别、切割或修饰DNA/RNA。依据Cas蛋白多样性，该系统目前被划分为7种类型和46种亚型，其中I型自然界最常见，II型尤其是CRISPR-Cas9研究最深入。文章概括了系统运作的三个阶段，即适应（adaptation）、加工（processing）和干扰（interference），构成其靶向识别与清除外源核酸的基础。该节为后文讨论CRISPR在益生菌中的应用提供了机制框架。
3.1. CRISPR-Cas system in LAB
在乳酸菌（LAB）背景下，作者强调CRISPR-Cas系统不仅是天然防御模块，也是重要的微生物基因组工程工具。已有研究表明，Lactobacillus和Bifidobacterium等多个LAB属中广泛存在CRISPR-Cas位点，超过半数已测序基因组携带该系统，提示其在抗噬菌体、维持基因组完整性和适应特定生态位方面具有显著进化优势。文中指出II型系统，特别是II-A亚型，在LAB中尤为常见。对于Enterococcus属，CRISPR-Cas位点与抗生素耐药基因之间存在负相关，提示其可能限制通过水平基因转移获得耐药决定子。作者列举了Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Lactobacillus及Lactococcus lactis中的具体研究实例，包括CRISPR相关基因的PCR鉴定、诱导型单质粒CRISPR-Cas9系统的构建，以及Cas9D10A切口酶（nickase）在L. casei基因组编辑中的应用。总体而言，本节认为深入解析LAB中CRISPR-Cas系统的多样性，将有助于食品发酵、噬菌体控制、菌株稳健性增强及下一代益生菌开发，但同时提醒其脱靶效应、种间差异、监管要求和生态影响仍需谨慎评估。
4. Development of CRISPR-based probiotics
本节聚焦CRISPR基础益生菌的形成及其技术价值。文章指出，早期针对Lactobacillus和Bifidobacterium的编辑主要依赖质粒介导同源重组或前噬菌体重组酶辅助方法，存在宿主范围窄、温度敏感、突变不稳定与编辑效率低等缺陷。CRISPR-Cas系统出现后，相关研究显著加速，尤其在乳杆菌和双歧杆菌中得到广泛应用。作者强调，CRISPR策略可增强益生菌对胆盐、酸性环境和氧化应激等生物及非生物胁迫的耐受力，同时CRISPR-Cas位点本身也被视为有助于基因组稳定性、环境适应和恶劣条件存活的重要基因组特征。文中列举多种代表性菌株及其CRISPR类型、所用系统和增强表型，例如提高耐酸耐胆盐能力、优化乳酸生成、增强黏附、改善发酵稳健性和免疫调节能力等。作者同时指出，CRISPR位点存在并不必然意味着功能性免疫活性，部分位点可能失活、不完整或表达水平较低，因此不能简单以位点数量推断益生潜能。
4.1. Practical implications of CRISPR-Cas systems in probiotics
作者进一步从应用策略层面总结了CRISPR在益生菌中的三种主要操作方式，即添加型、减除型和调节型。通过这些策略，可导入有益基因、删除有害特征或上调/下调目标基因表达，以达到定向功能优化的目的。文中以L. acidophilus中脂磷壁酸合酶基因lta的去除为例，说明外源nCas9D10A可改变菌株免疫调节谱；又以bshA基因启动子替换为例，展示通过增强启动子活性提高胆盐水解酶表达与酶活性的可行性。文章还提到，碳水化合物代谢相关基因的调节可改善肠道黏附与定殖，而在Lactobacillus reuteri中的CRISPR-Cas9联合单链DNA（ssDNA）重组已实现高恢复效率。除肠道适应性外，CRISPR还可通过增强groESL等伴侣蛋白表达，提高菌株在高温、加工与胃肠逆境中的存活能力，并支持外源糖代谢基因导入、胞外多糖生成及黏液结合蛋白表达增强。作者同时指出，工业放大、长期贮藏、法规限制及真实复杂微生态中性能不稳定等问题，是该类工程菌走向食品级和产业化应用的关键障碍。
4.2. Experimental identification of CRISPR-Cas system and genes in probiotic strains
这一部分概述了益生菌中CRISPR-Cas系统的实验与计算识别方法，强调应结合分子生物学与生物信息学开展综合分析。PCR被视为鉴定Cas基因的重要方法，可通过针对cas1、cas2、cas5、cas9等保守区域的特异性引物进行扩增，从而快速筛查传统及新型益生菌中的CRISPR-Cas基因。文中提到ctPCR等新方法以及在Enterococcus faecium益生菌株中的PCR验证案例，显示不同CRISPR相关基因在菌株间存在差异性分布。另一方面，作者指出全基因组测序结合CRISPRFinder、CRISPRCasFinder等工具，可实现对CRISPR位点、Cas基因、spacer序列与阵列结构的高效注释。文章以Lactiplantibacillus plantarum大规模公开基因组分析为例，说明可通过计算手段研究CRISPR-Cas系统的发生频率、结构变异、系统发育关系及进化特征。总体来看，本节强调了“实验确认+基因组挖掘”的技术路线对于后续筛选、表征与利用益生菌内源CRISPR系统具有基础意义。
5. Importance and applications of CRISPR-based probiotics
文章认为，CRISPR基础益生菌因具有更高阶的功能设计能力，正在多个领域展现重要价值。在研究层面，这类工程菌可用于特定生物标志物检测与疾病诊断；在功能设计层面，可提升存活性、耐受性及免疫调节潜能；在安全性优化层面，还可移除毒力或致病相关基因，从而构建更安全有效的益生菌株。作者举例说明，L. rhamnosus GG中的II型Cas9变体LrCas9已被成功开发为植物基因编辑工具；表达人P2Y
2嘌呤能受体的Saccharomyces cerevisiae可感知促炎分子；经CRISPR-Cas9编辑的Bacillus subtilis菌株在肥胖与代谢调控方面表现出积极作用。该节表明，CRISPR不仅改造了益生菌本身，也使其成为跨领域功能平台。
5.1. Therapeutic applications
在治疗应用方面，作者指出传统益生菌已有较明确的疾病管理潜力，而CRISPR工程化益生菌的治疗应用仍处于快速发展阶段。文中列举了产生丁酸盐的B. subtilis工程菌在肥胖动物模型中的应用，以及CRISPR基础益生菌在疫苗递送和免疫反应增强方面的研究。另一个实例是工程化Propionibacterium freudenreichii可释放维生素B
12和短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs），并在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中减轻肝脂肪变。作者同时提醒，这些工程菌的长期疗效、体内稳定性及环境释放后的潜在影响仍需进一步审慎评估。
5.2. Delivery applications
关于递送应用，文章指出益生菌天然具有作为肠道治疗载体的潜力，但其在加工、储存、定向定殖和体内功能释放方面仍面临限制。CRISPR技术可提升这类载体的功能设计能力。文中提到一种高效接合递送型CRISPR-Cas9系统，可在小鼠肠道中单剂量几乎清除全部抗生素耐药E. coli。作者据此认为，若能将先进递送技术与CRISPR工程进一步结合，将有望充分释放下一代益生菌在靶向治疗与功能输送中的潜力。
5.3. Enhanced metabolite production
在代谢产物增强方面，作者强调益生菌可产生SCFAs等后生元，而CRISPR-Cas系统允许对相关代谢通路进行精准改造，以提高丙酸盐、丁酸盐等关键代谢物产量，从而改善肠道微环境并可能影响肠-脑轴功能。与此同时，文章也指出益生菌代谢网络高度复杂，单基因编辑并不总能转化为可预测表型，因此需要结合多组学与代谢流分析进行系统层面的设计优化。
5.4. Enhanced metabolic activities
本小节指出，CRISPR技术还可定向调节益生菌中参与代谢活动的关键基因，如葡萄糖调节相关酶，从而提升整体代谢活性。不过作者同时强调，这类效应往往依赖多个相互关联的代谢通路，并非单一基因改变即可完全解释。
5.5. Next-generation probiotics
在下一代益生菌部分，文章提出CRISPR-Cas系统对新一代功能菌设计具有重要推动作用。相关菌株不仅可促进动物生长、改善饲料转化效率，还可通过竞争性排斥病原体发挥作用。文中还提到，商业益生菌通常具有更多CRISPR基因，而临床来源菌株则较少携带，支持CRISPR与抗生素耐药基因呈反向关系的观点。尽管这一方向发展迅速，但其安全性评价、宿主互作解析及体内验证仍是制约因素。
6. Limitations and challenges of using the CRISPR-Cas system in probiotics
文章专门讨论了CRISPR用于益生菌工程改造所面临的技术、监管与生物安全瓶颈。首先，不同宿主菌导入CRISPR组分的效率差异很大，受细胞壁结构、生长阶段、菌体密度、质粒骨架及电转化或化学转化条件等多因素影响，因而常需建立物种特异性方案。其次，抗生素筛选标记可能带来宿主不相容、体内快速丢失以及水平转移风险。作者还指出，非模式益生菌的操作污染、工程菌缺乏长期安全使用史、内置生物遏制系统设计复杂、临床验证不足以及缺乏统一的定殖能力、遗传稳定性、免疫原性和非预期效应评估标准，均限制了其临床推进。再者，不同国家对基因修饰微生物（GMOs）的监管体系差异显著，且针对CRISPR基础益生菌的专门规范仍不完善，导致其市场化和临床转化进展缓慢。作者据此将传统益生菌与CRISPR工程化益生菌进行对比：前者历史安全性较明确，但功能相对依赖天然菌株特性且缺乏精准性；后者具备靶向抑菌、动态微生态调节、优化代谢和生物传感等优势，但必须在严格生物安全和法规审查下推进应用。
7. Advancement of CRISPR-based probiotics over other engineered probiotics
作者随后比较了CRISPR编辑益生菌与其他遗传工程益生菌的差异，认为CRISPR-Cas9/Cas12a系统在精准删除、插入、替换基因方面具有更高准确性和更低非靶效应，相较传统限制性内切酶或早期编辑方法具有明显优势。通过改变导向RNA（gRNA）序列即可重定向靶位点，显著降低了工程复杂度。nCas9和dCas9等变体可在不引发DNA双链断裂的情况下实现基因编辑或表达调控，而多重gRNA策略使单细胞内同步靶向多个基因、改造复杂代谢途径成为可能。文章还提到，利用益生菌内源CRISPR-Cas系统可避免外源蛋白导入所致细胞毒性，且在原位应用场景中，可借助改造噬菌体向肠道微生物组中的特定细菌递送CRISPR组分，实现对病原菌的定向清除而尽量保留有益菌。
8. Consumer perspective about GMOs and CRISPR-based probiotics
在消费者认知层面，文章指出CRISPR工程化益生菌的商业化不仅受技术与监管限制，也受公众对基因修饰产品安全性、自然性及环境影响的担忧所制约。不同应用场景下消费者对GMOs的接受程度不同，通常对具有明确健康获益的改造更容易接受，但知识不足、问题复杂性及社会人口学因素均会影响判断。作者总结认为，当前消费者总体上对CRISPR基础益生菌持谨慎态度，通常偏好“天然”产品，并会关注新性状导入、既有性状删除、伦理问题及社会文化因素。文中还提及已有基于CRISPR平台的相关产品和企业探索，但总体仍处于有限批准或研发阶段，尚未形成广泛的商业化格局。
9. Future perspectives
最后，文章展望了CRISPR基础益生菌在食品、农业、医学及个体化医疗中的广阔前景。作者认为，未来研究重点将包括标准化编辑平台、优化递送系统、扩大可编辑宿主范围，以及通过多重编辑、改良质粒设计、合成生物学与组学整合，提升编辑精度并降低脱靶效应。文中尤其强调“益生基因组学（probiogenomics）+CRISPR”组合有望实现候选菌株有益遗传特征的理性识别与定制化设计。同时，Akkermansia、Faecalibacterium和Bacteroides等下一代益生菌由于培养与操控困难，更需要借助CRISPR改善其耐氧性、营养利用、生长稳定性和安全特征。文章还提出，人工智能（AI）与机器学习（ML）可用于优化gRNA设计、提高编辑效率并降低非靶效应，从而为高性能下一代益生菌的开发提供新范式。
10. Conclusion
结论部分指出，CRISPR-Cas系统正在推动益生菌研究由被动筛选走向靶向功能工程，促成更强胃肠环境存活性、更高黏膜黏附性及更丰富应用特性的菌株开发。然而，该技术仍受宿主依赖性、技术挑战、生物安全与监管不确定性制约。作者认为，只有在微生物学、基因组学、合成生物学、临床科学与监管科学等领域开展跨学科合作，并通过透明沟通与循证监管改善公众认知，CRISPR基础益生菌才可能从实验室创新真正迈向临床、营养与工业实践。
