《Cell Communication and Signaling》：Multi-omics and experimental evidence in human chondrocytes identify caspase-8 as a non-apoptotic regulator of inflammatory, senescent, and fibrotic signaling in osteoarthritis
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背景：骨关节炎（Osteoarthritis, OA）以慢性炎症、细胞衰老及进行性软骨重塑为特征，但有效的疾病修饰治疗靶点仍有限。Caspase-8（CASP8）经典上被视为外源性凋亡途径的关键启动子，但累积证据表明其依细胞环境发挥广泛的非凋亡调节作用。本研究
背景：骨关节炎（Osteoarthritis, OA）以慢性炎症、细胞衰老及进行性软骨重塑为特征，但有效的疾病修饰治疗靶点仍有限。Caspase-8（CASP8）经典上被视为外源性凋亡途径的关键启动子，但累积证据表明其依细胞环境发挥广泛的非凋亡调节作用。本研究系统探讨Caspase-8在OA发病中的作用及其治疗潜力。方法：研究人员整合批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）及空间转录组数据库、体外基因敲低、抑制剂滴定、Caspase活性检测与功能实验、定量蛋白质组学、计算机蛋白-蛋白对接分析及双样本孟德尔随机化（Two-sample Mendelian Randomization, MR）与SMR/HEIDI分析，构建并验证人OA软骨细胞中Caspase-8为中心调控网络。结果：在两个独立转录组队列（GSE168505和GSE246425）中，死亡诱导信号复合物（Death-Inducing Signaling Complex, DISC）-Caspase-8轴及Caspase-8激活特征在OA软骨组织及衰老（高代次）OA软骨细胞中显著上调，并与炎症及衰老相关程序强相关。衰老、小鼠内侧半月板失稳（Destabilization of the Medial Meniscus, DMM）及空间转录组数据分析显示CASP8模式具情境依赖性。scRNA-seq（GSE255460）将特征定位于OA扩增的炎性及纤维软骨样软骨细胞亚群，其中高CASP8基因表达定义独特转录状态——透明软骨基质及代谢程序受抑，伴TNFα/干扰素及TGF-β相关炎症-纤维化信号富集。Caspase-8激活分层重现上述特征并揭示多个软骨细胞谱系中衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）程序诱导。功能上，Caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK改善代谢活性、减少细胞衰老及MMP-13分泌且不诱导凋亡，并在炎性条件下部分恢复OA软骨细胞增殖与迁移，对非OA细胞作用较弱，对siRNA介导CASP8敲低细胞无作用。定量蛋白质组学显示Caspase-8抑制减弱炎症、衰老及经典NF-κB信号而不抑制凋亡，重塑蛋白稳态-染色质调控网络并抑制纤维软骨样基质重塑。计算机对接显示Caspase-8与TGF-β3、MMP13等有良好结合亲和力。MR及SMR/HEIDI分析支持CASP8为膝OA因果风险调节因子，受多组织表达及表观遗传调控影响。结论：Caspase-8是偶联软骨细胞炎症-衰老回路与纤维化重塑的核心非凋亡信号枢纽，是具前景的遗传及药理学治疗靶点，值得进一步药物开发与转化研究。
发表于《Cell Communication and Signaling》
论文解读
研究背景
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病，以软骨细胞功能障碍、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑及持续性低度炎症为特征，现有疗法多为对症处理，缺乏疾病修饰药物（Disease-Modifying Osteoarthritis Drug, DMOAD）。Caspase-8（CASP8）经典上被定义为死亡受体介导的外源性凋亡起始者，通过组装死亡诱导信号复合物（Death-Inducing Signaling Complex, DISC；含CASP8、FADD、TRADD、CASP10等）启动凋亡；但近年研究发现Caspase-8在特定细胞环境中可发挥非催化、非凋亡的支架（scaffolding）及信号调节功能，参与NF-κB活化、炎症应答及细胞分化。在人OA软骨细胞中，Caspase-8究竟以凋亡执行者还是非经典炎症/衰老调节者发挥作用尚未明确，也缺乏遗传学因果证据支持其作为OA驱动因子或治疗靶点的地位，因此研究人员开展此项整合多组学与实验验证的研究。
主要关键技术方法
研究人员采用多队列公共转录组数据集——包括人OA与正常软骨bulk RNA-seq（GSE168505、GSE246425）、人年龄相关软骨（GSE287861）、小鼠内侧半月板失稳（DMM, GSE26475）模型及空间转录组（GSE254844），人OA与正常软骨细胞scRNA-seq（GSE255460）；原代培养人OA及非OA关节软骨细胞进行TNF-α诱导的低度炎症模型构建，以Caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK处理及siRNA敲低CASP8，检测Caspase活性（Caspase-Glo?发光法）、细胞活力（CellTiter-Blue?）、增殖（BrdU ELISA）、细胞衰老（SA-β-Gal活性）、划痕愈合迁移能力及MMP分泌（ProcartaPlex?多重免疫检测）；进行定量蛋白质组学DIA-LC-MS/MS及Caspase-8与差异蛋白的计算机分子对接；采用双样本孟德尔随机化（Two-sample Mendelian Randomization, MR）及基于汇总数据的孟德尔随机化（Summary-data–based Mendelian Randomization, SMR）联合HEIDI检验，利用eQTL、mQTL及pQTL工具变量评估CASP8表达对膝/髋OA的因果效应。
研究结果
Transcriptomic analysis reveals transcriptional activation of the DISC–Caspase-8 axis in OA chondrocytes
分析GSE168505和GSE246425显示，OA软骨组织中DISC–Caspase-8轴基因（CASP8、FADD、TRADD、CASP10、CFLAR及TNFR家族死亡受体等）及Caspase-8激活评分显著高于非OA；晚代（复制性衰老）OA软骨细胞同样上调该轴。Caspase-8激活评分与细胞衰老（SAUL_SEN_MAYO基因集）及炎症反应（HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE）签名呈强正相关。自然衰老人软骨CASP8升高仅与衰老评分相关而与炎症无关；小鼠DMM模型Casp8无明显一致变化。提示DISC–Caspase-8轴转录激活及与炎症-衰老耦联是OA病理性特征，区别于生理性衰老或急性机械损伤。
Single-cell and spatial transcriptomic analysis reveals distinct distribution and functional bias of caspase-8 and DISC signaling in OA cartilage
对GSE255460进行scRNA-seq注释出11个软骨细胞亚群，OA中炎性（InfC/preInfC）及纤维软骨样（FC/preFC）亚群扩增，稳态（HomC）减少。Caspase-8激活及DISC模块特异地富集于InfC/preInfC，NF-κB及炎症响应模块同区域富集。CASP8及DISC组分（FADD、TRADD除外FC中有下调）在InfC/preInfC高表达。空间转录组显示CASP8表达具分区及负重依赖性异质性。关键发现：OA中CASP8上调未伴随DISC衔接分子及下游凋亡执行Caspase（如CASP3）协同上调，提示Caspase-8表达与经典DISC介导凋亡输出解耦。
CASP8-high chondrocytes exhibit suppressed matrix biosynthesis and enhanced inflammatory-fibrotic signaling
按CASP8中位表达分层，CASP8-high细胞富集于FC/preFC及InfC/preInfC。差异表达与通路富集显示CASP8-high细胞中透明软骨ECM组织、蛋白聚糖生物合成、糖胺聚糖代谢程序下调；而干扰素α/γ响应、TGF-β信号、上皮-间质转化（Epithelial–Mesenchymal Transition, EMT）、凝血及染色质重塑程序上调。蛋白互作网络确认下调基因为透明软骨基质（COL2A1、ACAN等）及分子伴侣（HSPA家族）。表明高CASP8表达关联基质合成抑制与炎症-纤维化信号增强的协调转录状态。
Caspase-8 high expression defines distinct inflammatory, fibrotic, and metabolic programs across chondrocyte lineages
各亚型内比较显示：InfC中CASP8-high激活SASP程序，FC中SASP受抑；HomC中TNFα/NF-κB信号选择性富集于CASP8-high，preFC中EMT及TGF-β富集，preFC还显示翻译起始及核糖体组装程序下调。细胞-细胞互作推断CASP8-high与CASP8-low群体在ECM-、黏附-及生长因子相关配体-受体互作（如LGALS9–CD44、ITGA/ITGB–胶原）上存在差异。提示Caspase-8依软骨细胞谱系产生特异性病理转录重编程。
Caspase-8 activation amplifies inflammatory–senescence signaling and suppresses matrix homeostasis in OA chondrocytes
按Caspase-8激活潜能（CASP8+FADD+TRADD+CASP10 UCell评分）分层，激活-high细胞较CASP8-high分布更广但仍富集preFC/FC。激活-high中CASP8、TRADD上调，软骨稳态基因（STC2、FRZB等）下调。Hallmark GSEA示TNFα/NF-κB、干扰素、TGF-β及EMT通路激活；SASP在ProC、InfC、RegC中诱导，preFC中抑制；下调基因为类固醇激素信号及软骨发育程序。说明Caspase-8激活潜能放大炎症-衰老-纤维化响应并抑制基质合成。
Modification of caspase-8 catalytic activity modulates chondrocyte senescence, proliferation, migration, and matrix metabolism in OA chondrocytes
原代OA软骨细胞经TNF-α刺激后CASP8 mRNA/蛋白升高但Caspase-8酶活未显著增加；Z-IETD-FMK有效抑制Caspase-8酶活性（基础及TNF-α条件下），并降低Caspase-1、-3/7、-9活性。Z-IETD-FMK处理提高TNF-α刺激下OA软骨细胞代谢活性与增殖，显著降低SA-β-Gal活性（基础及炎症状态），部分恢复划痕闭合能力，并选择性降低MMP-13分泌；不诱导凋亡（Caspase-3/7及Annexin V/7-AAD阴性）。非OA软骨细胞中Z-IETD-FMK仅抑制Caspase-8活性，对上述功能参数无显著影响。siRNA敲低CASP8（~85%）在OA细胞中无功能改变，提示催化位点抑制与基因敲除生物学效应不同，反映Caspase-8具非催化支架功能。
Integrated proteomic analysis reveals apoptosis-independent suppression of inflammatory and senescence pathways after caspase-8 inhibition
Z-IETD-FMK处理后OA软骨细胞DIA蛋白质组鉴定281个上调、174个下调蛋白。上调蛋白形成蛋白酶体-分子伴侣-染色质重塑（PSMD2、HSPA1A、HDAC1/2、SMARCB1等）蛋白稳态网络；下调蛋白形成纤维软骨样ECM重塑模块（COL1A1、TGFB3、FGF2等）及线粒体代谢模块。通路水平：固有凋亡通路蛋白无协调改变，炎症响应、细胞衰老及经典NF-κB（canonical NF-κB）信号被抑制，非经典NF-κB（non-canonical NF-κB）存活模块略升。计算机对接示Caspase-8与HDAC1、TGF-β1、MMP13等有良好预测结合能。表明Caspase-8抑制驱动不依赖凋亡的、向低分解代谢/高蛋白稳态状态的重编程。
Population-level genetic analysis supports CASP8 as a causal regulator in OA with broad tissue-wide effects
MR分析示遗传预测较高CASP8表达及循环Caspase-8蛋白水平与膝OA（Knee OA, KOA）风险增加显著相关，髋OA（Hip OA, HOA）同向但效应较弱；软骨细胞与外周血eQTL一致。CASP8启动子区CpG位点（如cg20608990）低甲基化因果关联KOA风险升高。SMR跨多组织（皮下/内脏脂肪、全血、骨骼肌、神经及动脉组织）显示CASP8与KOA共线信号（HEIDI P>0.01），适配基因CASP8AP2无显著关联。确立CASP8为OA易感因果介质，具全身多组织调控特征。
讨论与结论总结
讨论部分指出：本研究证明OA软骨细胞中Caspase-8功能从经典凋亡启动子偏移为非凋亡炎症、衰老及纤维化信号中枢，与软骨细胞II型凋亡细胞特性（死亡受体信号弱、需线粒体放大才执行凋亡）相符。Z-IETD-FMK抑制Caspase-8催化活性可间接降Caspase-3/7及Caspase-1活性，反映Caspase-8上游调控炎症小体及Bid介导的线粒体凋亡交叉对话。scRNA-seq揭示Caspase-8依细胞谱系驱动不同病理轨迹——InfC中强化炎症-衰老反馈环、HomC中促表型漂移向分解代谢、FC/preFC中促纤维化与代谢重编程。基因敲低无效而催化抑制有效，符合Caspase-8具DED（Death Effector Domain）介导的非催化支架功能，强调未来需开发靶向蛋白互作或表观/转录调控的策略。孟德尔随机化为CASP8作为OA因果风险因子提供人群水平证据，支持OA系统性疾病的观点。局限性含缺乏自发OA体内模型验证及Caspase-8结构域特异性机制未完全阐明。
结论（翻译）：综上，研究体外发现与人遗传学数据支持Caspase-8在OA炎症、衰老相关及纤维化重塑中发挥作用，并驱动软骨细胞从健康功能态向以慢性功能紊乱为特征的病理轨迹偏移。研究人员提出异常Caspase-8信号是软骨退变的关键触发因素而非被动后果。鉴于目前缺乏体内证据，需在更具生理相关性的人源模型（包括类器官）及适当时行临床前体内研究，以阐明其作为疾病修饰靶点的机制特异性与转化潜力。
