《Animal Diseases》：Streptococcus suis serotype 9: a rising threat with potential meningitis-inducing capability, population structure, virulence genes, and antimicrobial resistance
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猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）是猪链球菌病的主要病原体，也是一种新兴的人畜共患病病原体。近年来，猪链球菌9型（SS9）的流行已从主要为亚临床定植转变为侵袭性疾病，在多个国家的分离率持续上升。然而，与2型（SS2）相比，研究人员
猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）是猪链球菌病的主要病原体，也是一种新兴的人畜共患病病原体。近年来，猪链球菌9型（SS9）的流行已从主要为亚临床定植转变为侵袭性疾病，在多个国家的分离率持续上升。然而，与2型（SS2）相比，研究人员对SS9的了解仍然明显有限。本研究中，研究人员分析了7,913株猪链球菌分离株，其中SS9为第二流行的血清型，占9.12%（722/7,913），仅次于SS2的26.9%（2,132/7,913）。研究人员还分离了一株与脑膜炎相关的高毒力SS9菌株，并对722株SS9进行了全基因组分析。种群结构分析显示SS9内部存在显著的遗传多样性，包含168个序列型（Sequence Types, STs）和23个克隆复合群（Clonal Complexes, CCs），其中ST16为代表性的优势谱系。来自脑和脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）的分离株占主导地位（37.89%），加之缺乏来源特异性的系统发育聚类，提示SS9可能与中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）感染，特别是脑膜炎存在潜在关联。生物信息学分析揭示脑相关与非脑相关分离株之间17个毒力基因的分布存在显著差异，表明这些基因可能与脑膜炎相关。最常见的耐药基因为tet(O)（54.29%）和erm(B)（62.05%），36.98%的菌株同时携带四环素耐药和大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B（MLSB）类抗生素耐药基因。本研究旨在探讨SS9的脑膜炎相关致病性是否与特定毒力决定因子及多重耐药相关基因组特征的富集有关，从而增进对SS9致病性与耐药性的认识，并为改进疾病防控策略和公共卫生 preparedness 提供重要数据。
猪链球菌（Streptococcus suis）是猪链球菌病的主要病原体，可引起猪败血症、脑膜炎（meningitis）、心内膜炎和关节炎等疾病，同时也是一种新兴的人畜共患病病原，已在越南和泰国等国家导致数千例人类感染病例，并被确认为成人细菌性脑炎最常见的原因之一。基于荚膜多糖（Capsular Polysaccharide, CPS）抗原差异，猪链球菌可分为29种血清型（types 1–19, 21, 23–25, 27–31及1/2型）以及包括Chz型和26种新鉴定cps基因座在内的多种不可分型血清型。其中，SS2是全球猪群中最流行且毒力最强的血清型，也是导致人类猪链球菌感染最常见的血清型；而血清型1、4、5、7、9、14、16、21、24、31等也具有引发人类感染的潜力。
尽管不同地区临床病例中的优势血清型存在差异，SS2仍被认为是人和猪中最常见的血清型，因此大多数研究集中于SS2，忽视了其他流行率和毒力日益上升的血清型。然而，不同血清型在致病性和进化关系上表现出明显差异。2013年，泰国报道了首例SS9人类感染病例。近年来，SS9在多个国家的分离率稳步上升，已成为优势血清型，其临床表现从亚临床定植菌转变为侵袭性病原体。例如，SS9在多个欧洲国家已成为最流行血清型，分离率达43.0%，超过SS2的28.7%；在西班牙，SS9占分离株的27.6%；韩国2020-2023年的研究也显示SS9是最流行血清型（19.6%），略高于SS2（19.3%）。尤其值得注意的是，SS9在脑组织中的分离率最高，提示其可能与中枢神经系统感染相关。尽管SS9在临床分离株中日益占据优势，但关于其种群结构、基因组特征和毒力机制的综合研究仍然不足。
基于SS9日益增加的流行率及其频繁从脑相关样本中分离的现象，研究人员假设SS9的潜在致脑膜炎能力可能与独特的毒力基因谱和耐药性相关基因组特征有关。为填补这一空白，研究人员对1983年至2023年间从20个国家分离的722株SS9进行了分析，通过小鼠感染模型评估了4株实验室独立分离的SS9菌株的致病潜力和表型特征，并利用生物信息学方法系统分析了种群结构、进化关系、毒力基因谱和耐药性特征。
在致病性评价方面，研究人员选取了4株实验室分离的SS9菌株：两株来自健康猪扁桃体的分离株（1703A，ST243；1704A，ST243）和两株来自脑膜炎病猪脑组织的分离株（1701V，ST1307；1702I，ST243）。通过腹腔接种小鼠模型进行初步毒力评估，结果显示在所有三个感染剂量下，感染1701V和1702I的死亡率均高于1703A和1704A，表明1701V和1702I在小鼠中表现出更高的毒力和致病性。存活超过48小时的小鼠出现典型的脑膜炎临床症状，包括头部倾斜和转圈行为，提示1701V可能具有神经侵袭潜力。
为进一步评估致脑膜炎潜力，研究人员建立了尾静脉注射感染模型以模拟细菌病原体经血源性传播侵入中枢神经系统的途径。结果显示，1701V感染组的小鼠体重在感染后显著下降且持续降低，24-48小时间下降最为明显；而1702I和P1/7感染组仅出现轻微体重减轻。48小时时，1701V组小鼠表现出更明显的临床症状，包括频繁头部震颤、不自主点头、转圈行为和自发翻滚等特征性神经症状。与之相应，1701V感染小鼠的脑组织出现明显的病理改变，包括脑出血、脓肿形成和水肿。与强毒力、致脑膜炎SS2参考菌株P1/7相比，SS9菌株1701V表现出更明显的脑膜炎相关症状，提示其在该小鼠模型中诱导脑膜炎相关表现的能力更强。
在血清型和多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）方面，研究人员对7,913株全球基因组中的722株SS9进行了分析。SS9检测率为9.12%，仅次于SS2的26.9%。722株SS9主要来自荷兰（186/722，25.76%）和中国（146/722，20.22%）。MLST分析揭示SS9种群内部存在显著遗传多样性，共鉴定出168个不同的ST，最常见的ST为ST16（n=211），其次为ST243（n=70）、ST123（n=46）、ST1307（n=18）等。其余159个ST在菌株中检出次数少于10次。ST16主要分布在荷兰（107株）、法国（54株）和德国（23株），而ST243和ST1307仅在中国发现，具有明显的地域特异性。23个CC中，CC16、CC123等为优势CC，另68个ST不属于任何CC。SS9的谱系组成存在显著地理差异：欧洲分离株以ST16/CC16相关谱系为主，而中国分离株则以ST243和ST1307为特征。
基于核心基因组单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）的系统发育分析显示，SS9菌株在不同分离地点间呈一定程度的随机分布，但值得注意的是，来自脑和脑脊液（与脑膜炎相关）的分离株比例最高，占37.89%（86/227），提示SS9可能与脑组织侵袭及致脑膜炎潜力相关。此外，相当比例的分离株来自肺（47/227，20.70%）和血液（25/227，11.01%）。
在毒力相关基因（Virulence-Associated Genes, VAGs）方面，研究人员首先在722株SS9基因组中筛选推定人畜共患毒力因子（Putative Zoonotic Virulence Factors, PZVFs），共检测到20种PZVFs，其中cps2B（720/722，99.72%）、SP1（572/722，79.22%）、hylA（396/722，54.85%）、sly（361/722，50.00%）、Tran（343/722，47.51%）和Zmp（335/722，46.40%）最为常见。区域比较显示，Fhb_1、Sbp1、Sbp2、cbp40/omp40和sly等PZVF在欧洲SS9分离株中检出频率更高，而在中国分离株中缺失或罕见，表明SS9的人畜共患相关毒力谱存在地理异质性。
在227株具有明确解剖分离位点元数据的SS9基因组中，研究人员比较了脑相关（脑和脑脊液）与非脑相关分离株的差异。三种经典SS2毒力相关基因（mrp、epf和sly）的检出率分别为8.3%、7.9%和34.3%；143株不携带任何这三种经典毒力基因，84株（37.0%）至少携带一种。基于mrp、epf和sly的存在/缺失模式，鉴定出五种经典毒力基因型。进一步对122个VAGs的检测显示，4个基因（SSU05_0473、neuB、neuC和pnuc）在任何SS9分离株中均未检测到，40个VAGs在所有SS9基因组中保守存在。令人惊讶的是，17个VAGs在脑相关与非脑相关分离株间的分布存在显著差异，其中11个编码细胞表面或分泌蛋白，提示它们可能与SS9与宿主屏障的相互作用能力及致脑膜炎感染相关。这17个差异VAGs包括已报道的sly（可通过激活III组分泌性磷脂酶A
2（PLA2G3）增加血脑屏障的旁细胞通透性）以及可能通过调控下游毒力决定因子间接参与脑膜炎发病的5个转录调控因子和细胞壁修饰基因dltA。
为更系统地识别可能参与脑膜炎发生的新型候选基因，研究人员使用Pyseer和Scoary进行了全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）。Pyseer分析鉴定出329个与脑膜炎显著相关的基因（lrt-p值≤0.05），Scoary分析鉴定出257个符合显著性标准的基因（fisher_p值≤0.05且empirical_p值≤0.05）。两组基因集的交集包含10个基因，即comX、噬菌体/质粒引发酶（P4家族）、MdlB、UDP-半乳吡喃糖变旋酶（Glf）、推定转座酶、质粒重组蛋白、复制起始蛋白、两个编码假设蛋白的基因和解旋酶。这些基因包括与能力和免疫逃逸相关的comX、参与细胞壁合成和修饰的MdlB和UDP-半乳吡喃糖变旋酶样基因，以及几个参与基因组重组和修复的基因。
在耐药性方面，722株SS9基因组中共鉴定出32种不同的抗菌药物耐药（Antimicrobial Resistance, AMR）基因。620株（85.9%）携带1-9个AMR基因，102株（14.1%）未检测到AMR基因。大多数分离株（342株，47.4%）携带2个AMR基因，155株（21.5%）仅携带1个，123株（17.03%）携带3个及以上AMR基因。单个分离株中检测到的AMR基因最多为9个（erm(B)、tet(O)、sa(E)、ant(6)-Ia、aph(3')-IIIa、aad(6)-Ia、aac(6')-Ie-aph(2")-Ia、optrA和catA8），该多重耐药菌株属于ST2528，分离自马来西亚2019年的一株脑组织样本。
tet(O)（392/722，54.29%）和erm(B)（448/722，62.05%）是最常见的两种AMR基因，分别介导四环素耐药和大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B（Macrolides, Lincosamides, and Streptogramin B, MLSB）类抗生素耐药；267株（36.98%）同时携带这两种基因。575株（79.64%）至少携带一种可能介导四环素耐药的基因。tet(W)、tet(M)和tet(40)的检出率分别为17.17%、9.70%和1.80%。在MLSB相关耐药基因中，erm(B)最流行（62.05%），其他包括lsa(E)（8.03%）、vatE（1.25%）、lnuC（0.83%）、lnuD（0.55%）、lnuA（0.14%）和erm(T)（0.42%）。大环内酯外排或相关功能基因mel和mefE的检出率分别为2.63%和0.14%。氨基糖苷类修饰酶基因中，ant(6)-Ia（7.89%）、aph(3')-IIIa（4.29%）、aac(6')-Ie-APH(2")-Ia（2.77%）等被检出。苯醇类和噁唑烷酮类相关耐药基因的检出情况为：catQ（0.69%）、catA8（0.28%）、catP（0.14%）、cat.TC（0.28%）、fexA（0.14%）和optrA（1.94%）。叶酸途径相关dfr耐药基因dfrF和dfrG的检出率为0.55%，dfrK为0.14%。
进一步比较主要序列型之间以及脑相关与非脑相关分离株之间的耐药性差异发现，ST243每株携带的耐药基因数多于ST16（2.0 vs. 1.2），erm(B)和tet(O)在ST243中富集，而tet(W)在ST16中更常见。尽管ST243的多重耐药（Multidrug Resistance, MDR）率低于ST16（1.4% vs. 5.7%），但差异无统计学意义。与非脑相关分离株相比，脑相关分离株的平均耐药基因数略低（1.95 vs. 2.17），MDR率也显著更低（8.3% vs. 27.1%；Fisher精确检验，OR=0.244；95% CI 0.104–0.569；P=0.00043），提示脑相关侵袭性并非伴随增加的耐药负担。
中国与荷兰SS9分离株的区域比较显示，中国分离株携带更广泛且更集中的AMR基因，erm(B)和tet(O)的检出率特别高（分别为86.11%和84.72%），且ant(6)-Ia、aac(6')-Ie-aph(2")-Ia、tet(M)、lsa(E)和optrA等也有检出。相比之下，荷兰分离株的AMR谱相对较窄，tet(O)、tet(W)和erm(B)为最常见基因，但频率相对适中（分别为34.41%、34.41%和33.87%），表明SS9的AMR谱存在显著的地理异质性。
整合热图分析显示，脑来源分离株通常表现出相对富集的17个差异VAGs谱，但个体菌株间仍存在显著异质性；相比之下，AMR谱更为多变，主要以erm(B)和tet(O)的优势为特征。更高的VAG评分与更大的AMR基因负担或多重耐药之间未观察到统一的正相关，提示脑相关分离株共享相对富集的毒力相关基因组背景，而其耐药谱则更为多样化。
在低流行但临床重要耐药基因的遗传环境分析方面，研究人员比较了optrA周围遗传环境与其他细菌物种及代表性猪链球菌分离株中同源序列。在菌株2023WUSS095中，optrA-fexA区域与Enterococcus cecorum的同源片段显示出高度共线性，包括邻近的IS1216样转座酶相关基因，提示该耐药模块可能与水平转移有关。此外，几株猪链球菌中鉴定的optrA相关区域与Enterococcus faecium质粒K6D_p1上的optrA包含区域显示出强序列相似性，周围基因组织部分保守，包括附近的erm(A)相关结构。代表性猪链球菌分离株间的比较分析进一步揭示，尽管核心optrA包含区域相对保守，但侧翼基因组织在不同菌株间差异显著，表明该耐药模块在不同猪链球菌基因组背景中发生了结构多样化。这些发现提示，SS9中低流行但临床相关的耐药基因（如optrA）嵌入保守的移动相关遗传环境中，可能通过种间传播或共享耐药平台获得，随后在猪链球菌体内发生重组和多样化。
在讨论部分，研究人员指出，尽管数据集存在地理和时间分布不均、元数据完整度不一等局限性，仍揭示了SS9的广泛地理分布和长期持续存在。168个ST和23个CC的鉴定表明其具有显著的遗传多样性。ST16是优势谱系，携带更多推定毒力基因，与SS2人源菌株的基因组相似性较高，提示增加的潜在人畜共患性和毒力潜力。核心基因组SNP分析未显示按组织来源的明显聚类，但许多分离株来自脑和脑脊液，与中枢神经系统感染潜力一致。动物实验的局限性包括仅测试4株SS9、样本量小且无独立重复，尾静脉注射模型绕过了自然感染途径等。17个在脑相关分离株中富集的VAGs大多为编码表面相关或分泌蛋白的基因（如菌毛、IgdE、sbp1、sbp2、sao、sly、sspep等），可能促进CNS侵袭和脑膜炎；调控基因和细胞壁相关基因dltA的富集也提示转录调控和细胞壁重塑对神经侵袭的贡献。GWAS鉴定的10个候选基因涉及宿主适应（comX）、细胞壁合成和修饰（MdlB、UDP-半乳吡喃糖变旋酶样）、免疫逃逸及基因组重组等，表明SS9相关脑膜炎可能依赖于协调的生物学过程而非单一毒力决定因子。
在耐药性公共卫生意义方面，SS9表现出多样的AMR基因，tet(O)和erm(B)最为流行。一株脑来源分离株（ST2528）携带异常大量的AMR基因，突显了潜在的谱系特异性积累。脑相关分离株的总体耐药性不高于非脑相关分离株，提示CNS侵袭性与毒力相关基因组特征的关联强于与AMR的关联。中国分离株比荷兰分离株更富集MDR背景。optrA携带区域的比较分析提示水平基因转移，optrA-fexA模块与E. cecorum和E. faecium质粒的高共线性表明可能的肠球菌起源；结构变异提示获得后的重组和多样化。
研究方法上，4株猪链球菌分离株（1701V、1702I、1703A、1704A）经PCR鉴定为猪链球菌，cps靶向引物血清型分型确定为9型。1701V（ST1307）和1702I（ST243）来自脑膜炎病猪脑组织，1703A和1704A（均为ST243）来自健康猪扁桃体。初步毒力评估采用腹腔注射5周龄雌性ICR小鼠，每个感染剂量组4只小鼠。致脑膜炎能力采用尾静脉注射模型，每鼠感染1×10
8 CFU，每12小时测量体重和临床评分，SS2 P1/7为阳性对照，PBS为阴性对照。基因组DNA经标准文库构建后用Nanopore和Illumina平台测序，Unicycler组装，Prokka注释。MLST分型使用PubMLST数据库，goeBURST分析进化谱系。Abricate鉴定耐药基因和血清型/毒力基因。共分析128个VAGs，相似性<80%视为缺失。Roary进行泛基因组分析，Scoary和Pyseer进行GWAS分析。核心基因组SNPs使用Snippy鉴定，Gubbins去除重组区域，FastTree构建最大似然系统发育树（1,000次bootstrap），iTOL可视化。分类变量使用卡方或Fisher精确检验比较，AMR基因数组间比较使用Wilcoxon秩和检验。
