银纳米颗粒(Ag-NPs)与氧化锌纳米颗粒(ZnO-NPs)联合常用抗生素抗痤疮皮肤杆菌(Cutibacterium acnes)临床分离株的协同抗菌作用研究

《International Microbiology》：Antimicrobial synergism of silver and zinc oxide nanoparticles with antibiotics against clinical isolate of Cutibacterium acnes

　　

背景：由于痤疮皮肤杆菌(Cutibacterium acnes，原Propionibacterium acnes)对治疗寻常痤疮及其他皮肤感染的抗生素耐药性日益上升，亟需开发替代治疗方案。纳米颗粒(Nanoparticles, NPs)作为抗菌药物在与传统抗生素联用时显示出增强疗效的潜力。研究人员考察了银纳米颗粒(Ag-NPs)和氧化锌纳米颗粒(ZnO-NPs)单独及分别与常用抗痤疮抗生素联用对C. acnes的抗菌活性。 方法：研究人员利用苦豆子(Peganum harmala)水提物作为还原剂和稳定剂生物合成Ag-NPs和ZnO-NPs，并通过紫外-可见光谱(UV–Vis spectroscopy)、X射线衍射(XRD)、扫描/透射电子显微镜(SEM/TEM)及动态光散射(DLS)进行表征。研究采用两株C. acnes临床分离株(P1、P2)和一株参考菌株(NCTC747)，通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)，通过棋盘稀释法(Checkerboard assay)和分级抑菌浓度指数(Fractional Inhibitory Concentration Index, FICI)分析抗生素与纳米颗粒间的相互作用。 结果：成功合成球形Ag-NPs（平均晶粒尺寸约13–14 nm）和六方纤锌矿结构ZnO-NPs（平均晶粒尺寸约53–55 nm）。两种NPs均具固有抗菌活性。与抗生素单药相比，Ag-NPs联合用药使抗生素MIC降低2–8倍，多数组合FICI≤0.5，表现为协同作用(synergy)；ZnO-NPs联合用药使抗生素MIC降低2–4倍，FICI≈0.75，主要表现为相加作用(additive)，存在菌株依赖性差异。双因素方差分析显示MIC降低具统计学意义(p<0.001)。 结论：生物合成的NPs作为辅助制剂，通过抗菌及增强抗生素活性的作用，在管理C. acnes相关感染中具有潜在应用价值。

本研究发表于《International Microbiology》。

【研究背景】

寻常痤疮(acne vulgaris)是一种好发于青少年的常见皮肤疾病，其发病与毛囊皮脂腺单位中痤疮皮肤杆菌(Cutibacterium acnes，曾用名Propionibacterium acnes)过度增殖及宿主炎症反应密切相关。目前临床一线治疗常采用大环内酯类(如红霉素erythromycin)、林可酰胺类(如克林霉素clindamycin)及四环素类(如四环素tetracycline、多西环素doxycycline)抗生素，但随着长期、广泛的使用，C. acnes对这些药物（尤其大环内酯类和林可酰胺类）的耐药率不断攀升，导致常规疗法疗效下降、复发率升高并加剧耐药传播。纳米技术为抗感染提供了新思路——金属及金属氧化物纳米颗粒，如银纳米颗粒(Silver nanoparticles, Ag-NPs)和氧化锌纳米颗粒(Zinc oxide nanoparticles, ZnO-NPs)，可通过膜损伤、活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成、DNA干扰及离子释放等多重机制发挥抗菌作用，且与抗生素联用可能降低所需抗生素剂量、恢复耐药菌敏感性。植物介导的"绿色合成"(Green synthesis / Biosynthesis)利用植物提取物中酚类、生物碱等成分同时作为还原剂和稳定剂，较化学法更环保且可能赋予纳米颗粒额外生物活性。然而，此前鲜有研究针对植物介导合成的Ag-NPs和ZnO-NPs与抗痤疮抗生素联用，对C. acnes临床分离株进行定量协同作用评估（如棋盘法及FICI分析）。基于此，研究人员假设植物源Ag-NPs和ZnO-NPs可增强传统抗C. acnes抗生素的抑菌效力，因而开展此项体外研究。

【主要关键技术方法】

研究人员采集约旦安曼Prince Hamza医院未接受过抗生素治疗的痤疮患者皮损标本分离得到2株C. acnes临床分离株(P1、P2)，并选用参考菌株C. acnes NCTC747作对照。以佩加努姆苦豆子(Peganum harmala)种子水提物为还原稳定剂，分别生物合成Ag-NPs（硝酸银为前体，80℃反应）和ZnO-NPs（硫酸锌为前体，室温反应），通过UV–Vis光谱、XRD、STEM（Ag-NPs）/SEM（ZnO-NPs）及DLS（粒径、Zeta电位）表征。采用CLSI标准肉汤微量稀释法测定各抗生素及NPs单独作用的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)；在此基础上设计棋盘法(Checkerboard assay)，按亚抑菌浓度梯度组合抗生素与NPs，计算分级抑菌浓度指数(FICI = FIC_抗生素+ FIC_NPs= MIC_{组合中抗生素}/MIC_{抗生素单独}+ MIC_组合中NPs/MIC_NPs单独)，依据FICI≤0.5为协同(synergy)、0.5< />4.0为拮抗(antagonism)判定相互作用。实验设三重复，采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)及Tukey事后检验进行统计学处理。

【研究结果】

Ag-NPs and ZnO-NPs characterization（纳米颗粒表征）：UV–Vis显示Ag-NPs在430–440 nm处有典型表面等离子体共振峰，ZnO-NPs在~380–390 nm处有锐利吸收边，证实合成成功。STEM显示Ag-NPs为近球形、平均粒径10.9±2.7 nm（XRD估算晶粒度13–14 nm），DLS水合粒径15–20 nm，Zeta电位约-35至-40 mV；SEM显示ZnO-NPs呈聚集的球状至不规则形、平均粒径49.8±12.6 nm（XRD估算晶粒度53–55 nm），DLS主峰45–60 nm且有拖尾，Zeta电位约-20至-25 mV；XRD确认Ag-NPs为面心立方(fcc)银结构，ZnO-NPs为六方纤锌矿(wurtzite) ZnO结构，均无显著杂质峰。表明两种NPs结晶良好、Ag-NPs分散性及胶体稳定性优于ZnO-NPs。

MIC and MBC of Ag-NPs and ZnO-NPs（Ag-NPs与ZnO-NPs的MIC及MBC）：对三株C. acnes，Ag-NPs的MIC=MBC=125 μg/mL，ZnO-NPs的MIC=MBC=250 μg/mL，说明两者对C. acnes具浓度依赖性杀菌作用。

MIC of the selected antibiotics against C. acnes Clinical isolates and NCTC747 strains（四种抗C. acnes抗生素对临床株及参考株的MIC）：参考株NCTC747对各抗生素敏感（克林霉素1 μg/mL、红霉素0.5 μg/mL、四环素1 μg/mL、多西环素0.5 μg/mL）；临床分离株P1对克林霉素MIC=4 μg/mL（中介）、红霉素MIC=4 μg/mL（耐药），P2对克林霉素MIC=8 μg/mL（耐药）、红霉素MIC=4 μg/mL（耐药），四环素和多西环素对所有株仍保持较低MIC（0.5–4 μg/mL），符合临床耐药谱特征。

Effects of antibiotic–Ag-NP combinations on C. acnes（抗生素–Ag-NPs联用的效应）：在固定亚抑菌浓度Ag-NPs(31.25 μg/mL)存在下，四种抗生素对各株C. acnes的MIC均显著降低——克林霉素由1→0.125 μg/mL（参考株）、4→0.5 μg/mL（P1）、8→1 μg/mL（P2）；红霉素相应降幅为0.5→0.0625、4→1、4→2 μg/mL；四环素为1→0.125、2→0.25、4→0.5 μg/mL；多西环素为0.5→0.0625、0.5→0.125、1→0.25 μg/mL，总体降幅2–8倍。双因素ANOVA显示差异极显著(p<0.001)。

The impacts of ZnO-NPs on individual antibiotics when used to treat C. acnes（ZnO-NPs与抗生素联用的效应）：在ZnO-NPs(62.5 μg/mL)存在下，抗生素MIC同样显著降低——克林霉素降至0.125（参考株）、1（P1）、4 μg/mL（P2）；红霉素降至0.0625、1、2 μg/mL；四环素降至0.25、0.5、1 μg/mL；多西环素降至0.125、0.25、0.5 μg/mL，降幅多为2–4倍，统计显著(p<0.001)，但增效幅度普遍低于Ag-NPs组合。

Synergistic effects of combined antibiotics, Ag-NPs and ZnO-NPs based on FICI（基于FICI的协同作用分析）：Ag-NPs–抗生素组合的FICI多数为0.375–0.50（≤0.5），判定为协同(synergy)，其中耐药株P2与克林霉素/红霉素联用FICI=0.375（8倍MIC降低）；ZnO-NPs–抗生素组合FICI多为0.50–0.75，参考株部分达协同（FICI=0.375–0.50），临床株多表现为相加作用(additive, FICI≈0.75)，个别菌株/药物组合呈协同，未见拮抗。联用时Ag-NPs自身MIC由125降至31.25 μg/mL，ZnO-NPs由250降至62.5 μg/mL，提示相互增敏。

【讨论与结论总结】

讨论指出，植物提取物中生物碱、黄酮类等成分不仅介导了NPs绿色合成并改善胶体稳定性，还可能贡献一定生物活性。Ag-NPs较小粒径及更高Ag⁺释放能力使其更易致膜破坏与胞内损伤，故协同效应强于ZnO-NPs；ZnO-NPs通过Zn²⁺释放及ROS发挥相加效应。NPs可能通过增加膜通透性促进抗生素胞内积累、消耗细菌抗氧化防御、抑制外排或耐药基因表达等机制恢复抗生素敏感性，但具体分子机理未在本研究中验证。研究局限包括菌株数较少、仅为体外厌氧条件模拟、未进行哺乳动物细胞毒性及生物膜破坏的直接形态学观察。未来需扩大菌株、开展机制实验（膜通透性、ROS、基因表达）、体内模型及制剂安全性评价。

结论翻译：研究人员得出结论，生物合成的Ag-NPs和ZnO-NPs对C. acnes具显著固有抗菌活性，并能明显提升常规抗C. acnes抗生素的抑菌效力——与抗生素联用使MIC降低2–8倍，且Ag-NPs–抗生素组合主要表现为协同作用(FICI≤0.5)，ZnO-NPs–抗生素组合多表现为相加作用(FICI≈0.75–0.5)，无拮抗现象。这表明植物介导合成的纳米颗粒可作为抗生素佐剂(adjuvant)，通过降低所需抗生素浓度来减轻选择性压力，对管理C. acnes尤其是低敏或耐药株相关感染具转化潜力，值得进一步开展制剂开发与体内研究验证。