长链非编码RNA(lncRNA) TUG1通过miR-627/IGF1R轴促进增生性瘢痕形成

《Journal of Molecular Histology》：LncRNA TUG1 promotes hypertrophic scar formation via the miR-627/IGF1R axis

　　

摘要：增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)是由成纤维细胞(fibroblast)异常活化驱动的纤维化皮肤疾病，其分子机制尤其是非编码RNA的作用尚不完全清楚。研究人员采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测HS组织及成纤维细胞中lncRNA TUG1、miR-627及胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)的表达水平；通过双荧光素酶报告实验(dual-luciferase assay)验证直接相互作用；采用MTT法和Transwell实验评估TUG1与miR-627对成纤维细胞增殖(proliferation)和迁移(migration)的功能影响；建立兔耳HS模型观察体内调控TUG1和miR-627对瘢痕形成及分子表达的影响。结果显示：TUG1在HS组织中显著上调，与下调的miR-627呈负相关；TUG1通过直接吸附(sponging)miR-627解除其对促纤维化效应分子IGF1R的抑制，从而促进成纤维细胞增殖与迁移；荧光素酶实验证实miR-627直接结合TUG1及IGF1R的3'非翻译区(3'-UTR)；共转染miR-627模拟物可抵消TUG1引起的IGF1R上调并逆转其促纤维化细胞效应。体内实验中，TUG1过表达导致瘢痕增厚、胶原沉积增加及IGF1R表达升高，而miR-627过表达减轻上述表现，二者共处理可使瘢痕形态及分子标志物恢复至接近对照组水平。结论：TUG1通过吸附miR-627并去抑制(derepress)IGF1R促进增生性瘢痕形成。新发现的TUG1–miR-627–IGF1R轴在HS发病中起核心作用，可作为纤维化皮肤疾病的潜在治疗靶点。

论文解读：LncRNA TUG1通过miR-627/IGF1R轴促进增生性瘢痕形成的机制研究

增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)是深度真皮烧伤或创伤后常见的纤维化皮肤疾病，其特征为细胞外基质(exracellular matrix, ECM)过度沉积及成纤维细胞异常增殖活化，发生率可达70%，常伴疼痛、瘙痒及关节挛缩，严重影响患者生活质量。目前HS的临床治疗手段（手术、激光、放疗等）复发率高且疗效不一，其分子发病机制尚未完全阐明，尤其长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在皮肤纤维化中的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)调控网络仍有待探索。TUG1(taurine upregulated gene 1)作为已报道参与肝、心纤维化的lncRNA，在皮肤HS中的作用及下游ceRNA机制未知。胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)是已知的促纤维化信号分子，是否受TUG1–miRNA轴调控亦未见于HS报道。因此，研究人员假设TUG1在HS中作为miR-627的分子海绵(sponging)，解除miR-627对IGF1R的抑制，从而驱动纤维化表型，并对此展开研究。本研究发表于《Journal of Molecular Histology》。

主要关键技术方法概述

研究人员收集30例HS患者手术切除的HS组织、配对切缘正常皮肤(normal skin)及30例获自躯干/颈面/四肢的生理性正常愈合瘢痕即正常营养性瘢痕(normotrophic scar)组织；原代分离培养HS成纤维细胞(HSFs)与正常皮肤成纤维细胞(NSFs)。通过lncRNA芯片筛选差异表达lncRNA并锁定TUG1进行后续研究。体外实验采用TUG1过表达质粒(pcDNA3.1-TUG1)、TUG1特异性siRNA(si-TUG1)及miR-627模拟物(mimic)转染HSFs，以qRT-PCR和Western blotting检测分子表达，MTT法测增殖、Transwell法测迁移，双荧光素酶报告实验验证TUG1–miR-627及miR-627–IGF1R 3'UTR直接结合。体内实验采用新西兰大白兔耳全层创面HS模型(n=16，分4组：阴性对照scrambled agomir、TUG1 agomir、miR-627 agomir、TUG1+miR-627 agomir)，伤后1周局部多点注射干预，3周后取标本行苏木精–伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色、Masson三色染色、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测IGF1R及分子水平qRT-PCR/Western blotting分析。

研究结果

LncRNA TUG1 is upregulated in HS and promotes a pro-fibrotic phenotype in HSFs（TUG1在HS中上调并促进HSFs的促纤维化表型）

lncRNA芯片及qRT-PCR显示TUG1在HS组织中较正常皮肤及正常营养性瘢痕显著高表达，GO富集提示差异lncRNA富集于"miRNA介导基因沉默的负调控"及"miRNA结合"。功能实验表明：si-TUG1敲低TUG1后HSFs增殖与迁移能力下降（MTT、Transwell）；过表达TUG1则增强HSFs增殖与迁移。提示TUG1在HS中上调并具有促纤维化功能。

TUG1 acts as a molecular sponge for miR-627（TUG1作为miR-627的分子海绵）

生物信息学预测TUG1含miR-627互补结合位点。qRT-PCR示miR-627在HS组织中较正常皮肤及正常营养性瘢痕显著下调，且与TUG1表达呈负相关(Pearson)。双荧光素酶报告实验：共转染miR-627 mimic显著降低含野生型TUG1结合位点的报告载体荧光素酶活性，突变结合位点则消除该抑制。证明TUG1直接结合miR-627并负向调控其活性。

miR-627 directly targets and suppresses the pro-fibrotic gene IGF1R（miR-627直接靶向抑制促纤维化基因IGF1R）

TargetScan预测miR-627结合IGF1R 3'UTR。qRT-PCR示IGF1R在HS组织中高表达，与miR-627呈负相关。双荧光素酶报告实验：miR-627 mimic显著抑制含野生型IGF1R 3'UTR的报告载体活性，突变结合位点则取消抑制。证实miR-627直接靶向IGF1R 3'UTR并负调控其表达。

TUG1 exerts its pro-fibrotic function by regulating the miR-627/IGF1R axis（TUG1通过调控miR-627/IGF1R轴发挥促纤维化功能）

si-TUG1使HSFs中miR-627升高、IGF1R及纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β) mRNA和蛋白下降；过表达TUG1则miR-627降低、IGF1R/α-SMA/TGF-β升高，且TUG1与IGF1R mRNA在临床HS组织中呈正相关。 Rescue实验：TUG1过表达引起的IGF1R/α-SMA/TGF-β上调及HSFs增殖迁移增强，可被共转染miR-627 mimic显著逆转。表明TUG1通过吸附miR-627去抑制IGF1R驱动纤维化。

TUG1 promotes hypertrophic scar formation in vivo（TUG1在体内促进增生性瘢痕形成）

兔耳HS模型：TUG1 agomir组瘢痕隆起明显、真皮层增厚、胶原沉积紊乱(Masson)，IGF1R/α-SMA/TGF-β表达升高，miR-627降低；miR-627 agomir组瘢痕扁平、胶原排列较规整、上述分子下调；TUG1+miR-627共处理组大体形态、H&E及Masson染色、IHC及分子检测均接近阴性对照组。证实TUG1促HS形成依赖吸附miR-627而去抑制IGF1R。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，本研究首次在皮肤HS中证实TUG1高表达并通过ceRNA机制吸附miR-627，解除miR-627对IGF1R的转录后抑制，激活IGF1R及下游促纤维化信号，促进成纤维细胞活化、增殖、迁移及胶原沉积，确立TUG1–miR-627–IGF1R轴为HS发病新机制；兔模型首次展示操控该ncRNA网络可改善瘢痕，具转化潜力。局限性包括仅用雄性兔、未做时序动态检测、未直接单独抑制IGF1R验证功能及缺乏大动物或人皮肤移植模型验证，上游TUG1激活机制待探。靶向TUG1的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)、miR-627 mimic或IGF1R抑制剂可作HS新型治疗策略，TUG1也有望作HS诊断或预后生物标志物。

结论（翻译自原文Conclusion）：

本研究表明，lncRNA TUG1在增生性瘢痕组织及成纤维细胞中上调，通过作为竞争性内源RNA吸附miR-627，解除miR-627对促纤维化效应分子IGF1R的抑制，从而促进成纤维细胞增殖与迁移及体内瘢痕形成。新鉴定的TUG1–miR-627–IGF1R轴在HS发病机制中发挥核心作用，可能作为纤维化皮肤疾病的潜在治疗靶点。