《Tissue Engineering and Regenerative Medicine》：Remote Ischemic Preconditioning Enhances Skin Flap Survival via ZNF667/SDF1-Mediated Endothelial Progenitor Cells Functions for Angiogenesis
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远程缺血预处理（RIPC）可提高皮瓣存活率，但其机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨RIPC改善皮瓣存活的分子机制。研究人员将大鼠随机分为三组：假手术组（sham）、缺血/再灌注组（I/R）和RIPC+I/R组。I/R模型通过结扎髂腰动脉和胸背动脉诱导皮瓣缺血，随
远程缺血预处理（RIPC）可提高皮瓣存活率，但其机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨RIPC改善皮瓣存活的分子机制。研究人员将大鼠随机分为三组：假手术组（sham）、缺血/再灌注组（I/R）和RIPC+I/R组。I/R模型通过结扎髂腰动脉和胸背动脉诱导皮瓣缺血，随后再灌注建立；RIPC通过肢体夹闭实现。结合高通量测序、功能细胞实验和活体成像技术评估基因表达、细胞功能和皮瓣活力。结果显示，RIPC上调了ZNF667的表达。该蛋白作为VHL的转录抑制因子，与其启动子区域结合，竞争性抑制组蛋白修饰酶（包括MLL3/4、SETD1A和EP300）的募集。由此，组蛋白甲基化和乙酰化水平降低，导致VHL转录受到抑制。VHL的下调减弱了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的泛素化介导降解，进而增强了基质细胞衍生因子1（SDF1）的表达。这一信号级联反应促进了内皮祖细胞（EPCs）的增殖、迁移、分化和管腔形成能力。活体成像证实RIPC刺激了EPCs向皮瓣组织的募集，并伴有微血管密度的增加。这些效应共同增强了血管生成，并显著减少了皮瓣坏死面积。结论表明，RIPC通过调控ZNF667–VHL–SDF1轴并增强EPCs功能来改善皮瓣存活。这些发现不仅为皮瓣移植提供了潜在的治疗策略，也增进了对皮瓣存活机制的理解。
皮瓣移植在创面修复重建中具有重要作用，能够为复杂、高破坏性损伤提供有效的组织覆盖和功能恢复。然而，缺血-再灌注损伤（IRI）是皮瓣移植失败的主要风险因素之一，其导致的氧化应激和炎症反应可显著影响皮瓣血管生成，最终造成皮瓣坏死。远程缺血预处理（RIPC）作为一种非侵入性干预手段，通过肢体束缚诱导缺血预处理，相较于传统的局部缺血预处理具有更好的临床实用性，可减少手术时间并避免二次手术。尽管随机对照试验已证实RIPC的有效性和安全性，但其作用机制尚未完全阐明。血管生成是皮瓣移植成功的关键，内皮祖细胞（EPCs）在皮瓣术后血管生成中发挥核心作用，其来源于骨髓，可动员至外周血并归巢至缺血组织，分化为成熟内皮细胞以构建功能性血液供应。基于此背景，研究人员开展了该项研究，旨在揭示RIPC通过调控ZNF667–VHL–SDF1轴增强EPCs功能、促进血管生成从而提高皮瓣存活的分子机制，为优化皮瓣移植预后提供理论依据。该论文发表于《Tissue Engineering and Regenerative Medicine》。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：以Sprague–Dawley大鼠为对象建立皮瓣移植模型，分为假手术组、I/R组和RIPC+I/R组；利用高通量测序（Illumina NovaSeq平台）筛选差异表达基因；通过染色质免疫共沉淀（ChIP）验证ZNF667与VHL启动子的结合及组蛋白修饰酶的募集；采用电泳迁移 assays（EMSA）确认ZNF667与VHL基因启动子的特异性结合；运用双荧光素酶报告基因实验验证ZNF667对VHL转录的抑制作用；通过蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）检测HIF-1α的泛素化水平；利用流式细胞术鉴定EPCs表面标志物（CD34?/CD133?）及体内外EPCs动员和归巢情况；采用活体成像技术（AV600）示踪DiR标记的EPCs；借助多普勒血流仪测量皮瓣动脉血流速度。
基因表达分析显示RIPC调控ZNF667–VHL–SDF1轴。通过皮瓣移植手术和高通量测序，研究人员发现I/R组和RIPC+I/R组存在11个差异表达基因，其中NCOA1、SDF1、VHL和ZNF667与血管生成相关。PCR和Western blot验证显示，I/R处理上调了NCOA1、SDF1和ZNF667表达，下调了VHL表达；RIPC预处理进一步增强了这些效应，且JASPAR数据库预测ZNF667可作为VHL的转录抑制因子。
ZNF667作为VHL的转录抑制因子促进SDF1表达。通过体外缺氧/复氧（H/R）处理模拟体内I/R效应，研究人员在皮肤成纤维细胞（RDFs）中过表达ZNF667，发现其可进一步降低VHL表达并升高SDF1表达，而NCOA1过表达无此效应。ChIP实验证实ZNF667特异性结合VHL基因启动子的"TTAAGAGCTCA"序列，但不结合SDF1启动子；荧光素酶报告基因实验显示ZNF667过表达显著降低野生型VHL启动子的荧光素酶活性，而对突变型无影响。VHL敲低可增加SDF1表达，且VHL过表达可逆转ZNF667介导的SDF1上调，表明ZNF667通过抑制VHL促进SDF1表达。
ZNF667抑制VHL通过HIF-1α介导SDF1表达。EMSA实验确认了ZNF667与VHL基因启动子的直接结合，抗ZNF667抗体可产生超迁移条带。ChIP实验显示ZNF667过表达抑制了MLL3/4、SETD1A和EP300与VHL启动子的结合，导致H3K4me1、H3K4me3和H3K27ac等活化性组蛋白修饰减少。Co-IP实验表明ZNF667过表达降低了VHL总蛋白水平及其与HIF-1α的结合量，减少了HIF-1α的泛素化降解，从而稳定HIF-1α蛋白。HIF-1α敲低可 abolish ZNF667过表达引起的SDF1上调，且常氧条件下ZNF667单独过表达不影响SDF1，证实ZNF667对SDF1的促进作用依赖于HIF-1α。
ZNF667过表达的成纤维细胞促进EPCs增殖和分化。研究人员从外周血分离EPCs，通过CD34/CD133双阳性及DiI-acLDL/FITC-UEA-1摄取进行鉴定。Transwell共培养体系显示，与ZNF667过表达RDFs共培养可显著提高EPCs的存活率和EdU阳性增殖率；HIF-1α或SDF1敲低可阻断此效应。Western blot显示ZNF667过表达RDFs上调了EPCs中p-AKT、p-FAK和TGF-β水平，并促进VEGFR-2和PECAM-1表达，表明其促进EPCs向血管内皮细胞分化，该效应同样被HIF-1α或SDF1敲低所阻断。
ZNF667过表达的成纤维细胞促进EPCs迁移和管腔形成。划痕实验和Transwell实验均显示，ZNF667过表达RDFs的条件培养基可增强EPCs迁移能力，HIF-1α或SDF1敲低消除该效应。管腔形成实验表明，该条件培养基促进EPCs形成毛细血管样结构，此效应同样依赖于HIF-1α和SDF1。
RIPC诱导EPCs蓄积和血管生成从而防止皮瓣坏死。流式细胞术显示，I/R组外周血CD34?/CD133? EPCs比例高于假手术组，RIPC+I/R组进一步增高；皮瓣组织中内源性EPCs归巢呈现相同趋势。Western blot证实RIPC+I/R组皮瓣中ZNF667、HIF-1α和SDF1蛋白水平高于I/R组，VHL水平更低。HE染色显示RIPC+I/R组微血管密度增加。体内成像显示RIPC促进DiR标记的EPCs向皮瓣募集，该效应被ZNF667或SDF1敲低以及CXCR4拮抗剂AMD3100阻断。多普勒血流测量表明RIPC改善I/R损伤后的动脉血流速度，此效应同样被上述干预 abolish。皮瓣坏死面积分析显示RIPC显著减少坏死面积，而ZNF667/SDF1敲低或AMD3100处理削弱其保护作用。
在讨论部分，研究人员总结了该研究的核心发现：RIPC通过激活ZNF667–VHL–HIF-1α–SDF1信号轴，增强EPCs介导的血管生成，从而改善皮瓣存活。该研究揭示了这一轴表的新型表观遗传调控机制——RIPC诱导的ZNF667通过竞争性抑制组蛋白修饰酶MLL3/4、SETD1A和EP300的募集，表观遗传沉默VHL基因，进而稳定HIF-1α、上调SDF1表达，促进EPCs的动员、归巢和功能发挥。研究人员还提出了RIPC效应的双相模型：系统性阶段涉及预处理肢体释放的体液因子或神经信号，以及骨髓来源EPCs的动员；局部阶段则在目标皮瓣中激活ZNF667–VHL–SDF1轴，为募集的EPCs提供趋化信号，二者协同促进血管生成。研究也指出了shRNA介导敲低可能存在脱靶效应的局限性，建议未来采用CRISPR/Cas9等更特异的基因工具进行验证。
研究结论部分指出，总体而言，研究人员的发现证明RIPC通过激活ZNF667–VHL–HIF-1α–SDF1轴增强EPC介导的血管生成，从而提高皮瓣存活率。该研究揭示了这一轴的新型表观遗传机制：RIPC诱导的ZNF667通过竞争性抑制组蛋白修饰酶MLL3/4、SETD1A和EP300的募集来抑制VHL转录，导致VHL下调，进而稳定HIF-1α、上调SDF1表达、增强EPC募集和功能，最终改善血管生成和皮瓣存活。这些见解不仅增进了对RIPC保护机制的理解，也凸显了靶向该轴以改善皮瓣移植及其他涉及缺血-再灌注损伤疾病预后的治疗潜力。
