综述：内生虫生真菌：菌物学生物防治的新前沿

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Endophytic entomopathogenic fungi: The next frontier in mycological biocontrol

　　

虫生真菌(EPF)是化学农药的环境友好型替代品，但高成本、制剂不稳定性、环境敏感性及毒力变异性限制了农户采用。研究人员认为，这些问题可通过将已定殖为内生菌的EPF菌株加以利用来解决。内生虫生真菌(EEPF)能够调控挥发性物质释放以吸引害虫天敌，这一特性使其成为农业生产中的双重用途生物防治因子。作为内生菌，此类真菌具有持效性，可降低害虫防治成本。EEPF还能促进植物生长并提高对非生物胁迫的耐受性。针对EEPF定殖植物组织、在植物体内持久存活及对昆虫毒力的分子机制研究显示，EEPF可能通过从植物中获得水平基因转移(HGT)来获取毒力因子和代谢多功能性。因此，在植物体内建立并维持EPF的内生状态，可弥补EPF在人工培养基上反复继代培养导致的毒力丧失。尽管EEPF具备上述潜在优势，仍面临田间条件下内生定殖变异性、寄主特异性、生态风险及规模化应用等挑战。本综述批判性评估这些局限性，重点关注绿僵菌属(Metarhizium)、白僵菌属(Beauveria)和蜡蚧菌属(Lecanicillium)等已充分研究的类群，并展望提高EEPF应用可靠性的未来方向。通过整合生态学、分子生物学与应用视角，研究人员构建了一个全面且更新的理论框架，将EEPF定位为可持续农业中的下一代生物防治因子。

引言

过去二十年间，虫生真菌(EPF)已成为农业领域的生物防治因子，目前已报道约1791种EPF隶属于90至100个属，广泛分布于子囊菌门、担子菌门等多个类群，但仅有250种被开发和商业化应用。EPF市场扩张既源于其相较于化学杀虫剂的环境安全性优势，也得益于孢子大规模生产技术的进步。全球每年因害虫造成的作物损失约为20%，但EPF的田间表现始终不稳定：不同菌株对靶标害虫的毒力存在差异，且多数EPF制剂为体外喷施，易受湿度、紫外线等环境变量影响，持效期有限。现有改进策略如油基分散体可增强分生孢子对昆虫疏水表皮的附着并提供脂质保护以减少低湿条件下的干燥失活，但高浓度下存在潜在植物毒性；木质素、壳聚糖等生物聚合物微胶囊化可有效屏蔽紫外B辐射，却常导致分生孢子活力下降并在接触宿主时出现萌发延迟，同时加工与包装环节进一步推高了农户使用成本。相比之下，内生虫生真菌(EEPF)是一类共生真菌，可在不引发病害症状的前提下定殖植物组织，同时保留侵染并致死广谱昆虫害虫的能力，兼具植物内生定殖与昆虫坏死营养寄生双重功能。EPF系统性定殖植物组织后能提供持效性害虫防护，减少对外源化学农药的依赖，还可增强植物对生物与非生物胁迫的抗性。目前EEPF已被视为传统化学农药及周期性体外喷施EPF的潜力替代方案，但在田间稳定定殖机制、寄主特异性变异、次生代谢产物潜在生态风险及规模化应用等方面仍存在认知缺口，真菌基因组特征与毒力、内生性等功能表型的关联也有待解析。本综述系统区分EEPF与传统EPF的差异，整合其生态学、定殖策略与昆虫致病性研究进展，重点关注绿僵菌属、白僵菌属和蜡蚧菌属等核心类群，识别制约其开发与商业化的关键瓶颈，并提出未来研究方向。

虫生真菌

绿僵菌属(Metarhizium)、白僵菌属(Beauveria)和蜡蚧菌属(Lecanicillium)是EPF中研究最深入的类群，均隶属于子囊菌门。绿僵菌属呈全球分布，可侵染鞘翅目、鳞翅目、双翅目等多目害虫，其中金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)是全球生物防治项目的常用菌株，可在土壤和根际持续存活数月至一年以上，如金龟子绿僵菌在甘蔗田土壤中可持效达3.5年。该属包含专化性谱系，如专性侵染直翅目的蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)和主要防控夜蛾科的莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)，这种生态分化反映了其寄主适应策略与侵染机制的差异。绿僵菌属可定殖番茄、玉米、高粱、大豆等多种植物，其寄主广谱性与内生定殖能力存在潜在关联。基因组层面，广宿主谱物种通常扩张了编码蛋白酶、几丁质酶的基因家族及次生代谢产物生物合成基因簇，以支持广谱寄主侵染；而专化性菌株基因组收缩，基因数量较少，虽仅能侵染单一目昆虫，但在靶标类群中侵染效率更高。目前已测序的绿僵菌属基因组大小为37~42 Mbp，编码约10000~11000个基因，富含负责次生代谢产物合成与寄主适应的基因簇，基因组大小差异对应着腐生、虫生、内生等多生活方式切换所需的复杂基因与基因簇储备，其独特的分泌蛋白组（如丝氨酸和天冬氨酸内肽酶）是降解寄主表皮与环境适应的核心基础。金龟子绿僵菌E6菌株基因组约38.5 Mbp，GC含量为51%，与该属其他物种及白僵菌属一致，反映出该类群保守的基因组架构。

白僵菌属(Bauveria)的寄主范围涵盖鞘翅目、双翅目、半翅目等多类昆虫，已从全球不同区域的土壤、昆虫及植物组织中分离获得。其中球孢白僵菌(B. bassiana)的研究与商业化程度最高，对烟粉虱(Bemisia tabaci)、温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)等粉虱科害虫防效显著，本土分离株对番茄叶片上烟粉虱卵和若虫的消除率分别可达66%和65%，优于化学杀虫剂苯氧威。系统发育分析显示该物种存在10个进化谱系，菌株间对粉虱的毒力差异显著，但缺乏严格的寄主或地理特异性，目前已报道可在约25种植物中定殖为内生菌。其基因组大小约33~37 Mbp，预测编码超过10000个基因，群体基因组学研究揭示了显著的种内遗传结构与适应性、毒力分化的关联。

蜡蚧菌属(Lecanicillium)曾归类于Verticillium属，也是主要的内生虫生真菌类群之一，普遍存在于全球昆虫生境中并可定殖作物植物。其中莱氏蜡蚧菌(L. lecanii)是防控害虫与病原菌的潜力菌株，田间试验显示含莱氏蜡蚧菌和萨克森蜡蚧菌(L. saksenae)的生物胶囊可使豇豆蚜虫种群数量降低90%以上，对棉蚜(Aphis gossypii)也有良好防效。系统发育与形态学研究将该属划分为8个独立分支，其谱系多样性源于与昆虫的长期协同进化及对不同环境的适应，而非白垩纪-第三纪灭绝事件等地质危机的结果。该属基因组大小为31~36 Mbp，最大基因组包含11009个预测蛋白质编码基因与197个 scaffold。

昆虫-虫生真菌互作

EPF与EEPF的昆虫侵染机制基本一致，可分为四个阶段：分生孢子通过疏水相互作用与黏胶附着于昆虫表皮，金龟子绿僵菌的黏附蛋白MAD1、白僵菌属的疏水蛋白是这一阶段的核心功能分子；附着后孢子萌发并释放几丁质酶、蛋白酶等降解昆虫表皮，可通过菌丝直接穿透或形成附着胞产生机械压力侵入，此过程中昆虫会激活表皮抗菌物质合成及理毛、体温调节等行为防御；穿透表皮后真菌进入血淋巴，通过修饰细胞壁组分转化为芽生孢子以逃逸寄主的细胞与体液免疫应答，同时合成杀虫毒素（如球孢白僵菌的绿僵菌素、莱氏绿僵菌的白僵菌素）并操控寄主行为，最终在血腔内大量增殖导致寄主死亡；最后真菌从死虫体表长出并产孢，完成生活史循环。昆虫与EPF的互作经历了数亿年的协同进化，昆虫的先天免疫应答（表皮防御、细胞免疫、体液通路、抗菌肽合成）是决定EPF侵染强度的核心因素，二者处于持续的进化军备竞赛中。

内生虫生真菌与植物寄主互作

EEPF定殖植物的分子机制始于分生孢子对植物表面的附着：金龟子绿僵菌的黏附蛋白MAD2仅在植物微环境中诱导表达，其敲除突变体无法附着植物表面，证明MAD2是内生定殖的关键因子。孢子喷施叶片后，菌丝可进入叶肉细胞间隙并偶尔扩散至木质部，植物通过模式识别受体感知微生物相关分子模式，EEPF需通过多种策略规避植物先天免疫：修饰几丁寡糖以减少几丁质特异性受体激活、分泌效应蛋白抑制植物防御信号通路、合成次生代谢产物干扰茉莉酸与水杨酸介导的激素防御通路，最终建立互惠共生关系。基因组研究揭示7株绿僵菌存在水平基因转移(HGT)信号，表明其可从细菌、古菌、节肢动物、植物甚至脊椎动物中获取基因，支持了其兼具昆虫病原与植物共生功能的演化基础。

EEPF在植物体内定殖后可发挥多重功能：一是提供系统性害虫防护，昆虫取食感染植株后，氮素可从被杀死的昆虫转移至植物，作为交换真菌获取植物源碳水化合物；二是诱导植物系统抗性，通过重编程次生代谢激活防御相关通路，提升酚类、萜类、黄酮类、生物碱及挥发性有机物(VOCs)的合成水平，增强对植食性昆虫的驱避与毒性；三是调控植物激素平衡，合成生长素、赤霉素、细胞分裂素等植物激素促进植物生长，同时提升植物对非生物胁迫（盐渍、干旱、重金属、温度胁迫）的耐受性；四是参与植物修复，部分EEPF可辅助降解土壤中的烃类、重金属及工业污染物。此外，EEPF定殖会改变植物的挥发性有机物排放谱，在蚜虫取食等胁迫场景下释放差异化的挥发物组合，其中顺式茉莉酮、茉莉酸甲酯等信号分子可吸引害虫天敌，通过多营养级互作实现间接害虫防控。

EEPF在农业害虫防控中的应用前景

相较于传统EPF与化学杀虫剂，EEPF具备显著优势：无有害残留，可减少土壤与水体的污染风险；内生定殖不受高温、高湿等环境条件限制，持效期更长，可减少施药频次；可与害虫综合治理(IPM)体系兼容，降低对有益土壤微生物区系与节肢动物的负面影响；兼具促生与抗逆功能，可同步提升生物多样性与生态系统稳定性。田间与温室试验验证了EEPF的实际防效：球孢白僵菌定殖罂粟后可减少伊拉蜂(Iraella luteipes)取食近70%；香蕉中定殖该菌可使香蕉根蛀犀金龟成虫死亡率接近60%，植株受害率降低63%；棉蚜在接种球孢白僵菌与淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)的棉花上死亡率显著上升；喷施与土壤浇灌处理下，球孢白僵菌对番茄潜叶蛾(Tuta absoluta)的防效优于常规喷施处理，且可降低棉铃虫(Helicoverpa armigera)对番茄的危害。此外，EEPF还可通过改变植物挥发物谱、直接侵染害虫、吸引天敌等多途径发挥作用，相较于非内生EPF，其分生孢子因植物介导的疏水蛋白与黏附蛋白表达上调，对昆虫表皮的附着效率更高，几丁质酶、蛋白酶等酶活性更强，配合植物源因子可显著提升害虫死亡率，在更低孢子浓度下实现更快的致死速度。

EEPF菌株的分离与保藏

土壤是分离绿僵菌属、白僵菌属等EPF的主要来源，未受干扰的森林、山地等区域土壤中的EPF多样性显著高于农业环境，且可最大限度减少商业化菌株污染。采样时需记录土壤类型、pH、生境类型、海拔、GPS坐标与年度气候数据，采集5~10 cm深度的土样，若3小时内处理可室温保存，否则需4℃避光冷藏不超过一周。分离采用土壤稀释涂布法，选择性培养基含蛋白胨、葡萄糖、链霉素、四环素、放线菌酮与多果定，pH调至7.0，28℃培养，两周内监测菌落生长，挑取单菌落转接至新鲜培养基纯化，通过菌落与孢子形态显微镜观察初步鉴定，纯菌株可保存于马铃薯葡萄糖琼脂斜面。需注意EPF反复继代培养会导致菌株退化，表现为毒力丧失、酶活性下降与表型变异，可通过从自然感病昆虫或植物的定殖组织中重新分离菌株来维持其毒力与活性。研究发现，从少受咀嚼式昆虫危害的植物根际分离的EPF毒力可达土壤分离株的两倍以上，仅需十分之一孢子量即可达到同等防效，推测与内生阶段的水平基因转移获得杀虫性状有关。由于根际分离的EPF与EEPF难以直接区分，需通过严格的毒力测定与内生定殖能力验证来筛选目标菌株。

杀虫特性评价

EEPF杀虫特性的评价包含直接方法与互补方法两类。直接方法以昆虫生物测定为核心：标准浸虫或接触法测定孢子浓度下的害虫死亡率、致死时间，结合死虫体表真菌长出情况确认致病性；卵期生测以新鲜产卵为靶标，统计孵化成功率与后续幼虫存活率，可评估跨龄期延迟效应；2龄幼虫生测则聚焦明确发育阶段的致死率与真菌定植情况；田间验证是将室内筛选的高毒力菌株制成制剂开展小区与多地点试验，如球孢白僵菌BKN20菌株的水悬剂在茶小绿叶蝉防控中防效与噻虫嗪相当，且无植物毒性，对非靶标天敌无致病性，证实实验室毒力结果可向田间实效转化。

互补方法用于解析毒力差异的机制：真菌适合度指标（菌丝生长速率、产孢量、附着胞形成能力、LT₅₀、LT₉₀）可细化菌株间侵染动态差异，综合生物效价指数比单一死亡率指标更具筛选价值；胞外酶活性（蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶）与EPF对昆虫表皮的降解能力直接相关，高酶活性菌株对粉虱等害虫的致死率显著更高；分子标记与基因表达分析可通过qPCR定量真菌在昆虫、植物与土壤中的生物量，结合RT-qPCR检测毒力相关基因（如白僵菌素合成酶基因）的表达时序，揭示致病过程的分子调控机制；比较基因组学与分泌组学分析可解析EPF的毒力相关分泌蛋白、角质层降解酶与次生代谢基因簇演化特征；代谢组学则可鉴定破坏素、白僵菌素、细极链格孢啶等核心杀虫次生代谢产物，解释菌株间毒力强度与寄主范围的差异。上述方法需与经典生物测定结合，才能全面评估EEPF的性能。

植物体内EEPF定殖效率与植物介导效应

EEPF的内生定殖效率与持效性是影响其对植食性昆虫作用效果的核心因素，定殖通常呈局部性与短暂性，但仍足以调控昆虫与植物的响应。分子检测方法（如PCR、qPCR）可准确追踪EEPF在玉米等作物组织中的定殖动态，定殖成功的同时常伴随植物生长指标的改善。整合真菌适合度、酶活性、分子标记、基因组与代谢组数据，可系统解析EEPF在植物介导的间接防御中的作用机制，为可持续农业生物防治提供更全面的应用依据。

植物体内EEPF定殖建立方法

目前已建立多种EEPF植物体内定殖技术：叶面喷施是将孢子悬浮液喷施于叶片表面，喷施前24小时按土壤持水量浇水，喷施时覆盖盆面铝箔减少径流，喷施后将植株套袋保湿24小时，该方法定殖率达80%，所需孢子浓度可比其他方法低一个数量级，但需大面积覆盖作物；土壤浇灌是将孢子悬浮液浇灌于植株基部，可实现根系高效定殖并向地上部系统扩散，持效期长，适配温室与田间场景，但易受土壤吸附、微生物竞争、水分含量波动影响，稳定性较低；种子处理是将表面消毒的种子用孢子悬浮液包衣后播种，可从苗期开始提供防护，兼容现有种子包衣工艺，适合规模化应用，但成功率受种子类型、土壤温湿度与菌株特性影响较大，且易受土著微生物竞争；根蘸处理是将幼苗根系清洗后浸入孢子悬浮液24小时，可实现根系高效定殖，部分菌株可扩散至茎叶，适合移栽作物，但不适用于直播作物与大规模田间作业；茎干注射是用注射器将孢子悬浮液注入茎基部节间，对茎组织定殖效率高于喷施与浇灌，多用于木本作物；根茎处理是将根茎浸泡于孢子悬浮液90分钟，主要用于芭蕉等作物；胚根包衣是将萌发的种子胚根浸泡于孢子悬浮液中，已在可可幼苗定殖中取得成功。不同方法的定殖效率、适用场景与局限性存在差异，需结合作物类型与目标害虫选择最优方案。

植物体内EEPF定殖效果评价

定殖效果验证首先通过组织分离法：将表面消毒的植物根、茎、叶组织切块接种于选择性培养基，培养后观察真菌生长，挑取单菌落纯化，结合形态学确认EEPF定殖。随后开展离体与整株生测：离体叶片生测将定殖植株的叶片饲喂靶标害虫，统计幼虫死亡率、取食量与亚致死效应（生殖力下降、卵孵化率降低）；整株(in planta)生测将昆虫直接接入定殖植株，评估植物介导的系统抗性对害虫种群增长的抑制作用，如球孢白僵菌与淡紫紫孢菌种子或茎部接种可显著降低棉蚜种群数量，证实内生定殖的间接防控潜力。

EEPF毒力提升机制

EEPF对昆虫的毒力显著高于自由生活的EPF，核心机制是植物-真菌互作过程中的水平基因转移(HGT)。研究已证实植物与真菌之间存在双向基因交流，如刺盘孢属(Colletotrichum spp.)约1.5亿年前获得了植物来源的枯草杆菌蛋白酶基因，在侵染玉米时上调表达，通过分子模拟辅助植物致病；丛枝菌根真菌不规则根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)获得了37个细菌与植物来源基因，半数可功能表达；植物病原真菌 Magnaporthales 与刺盘孢属之间存在超过90个基因的转移，多编码碳水化合物活性酶，辅助真菌降解植物细胞壁。具体到EEPF，从番荔枝(Annona squamosa)根际分离的金龟子绿僵菌菌株对棉铃虫毒力显著高于其他植物根际分离株，基因组中检测到植物来源的杀虫肽编码基因，推测为内生阶段水平转移所得，该现象在其他具杀虫活性的植物（如印楝、辣椒、木瓜）根际分离株中也得到验证。

针对EPF反复继代培养导致的毒力退化，除昆虫复壮与转基因导入毒素基因外，可利用HGT特性定向提升毒力：将EEPF接种于具杀虫或抗虫性状的植物，使其自然获取并表达植物源杀虫基因，再通过连续接种不同杀虫植物实现多轮HGT，丰富杀虫性状组合。但需注意真菌内部的重复诱导点突变(RIP)机制可能沉默或降解外源DNA，且水平转移获得的性状稳定性取决于基因获取、内部防御机制与植物-昆虫-真菌三方选择压力的平衡，目前对HGT的具体机制仍有待解析。现有假说包括RNA介导机制（植物mRNA通过细胞外囊泡进入真菌细胞，经逆转录为反转录转座子后整合到真菌基因组重复富集区）、细胞器捕获（通过线粒体或质体瞬时融合将植物DNA转入真菌）、环境DNA(eDNA)直接摄取（真菌菌丝从损伤植物组织中吸收游离DNA后通过非同源末端连接整合），但均缺乏直接实验证据。

水平基因转移的功能验证需依托多组学手段：全基因组测序可筛选GC含量、密码子使用偏好异常的候选基因，结合比较基因组学与系统发育分析判断其是否为植物来源；转录组学与RT-qPCR可验证候选基因在不同环境下的表达活性，确认其是否参与植物互作或胁迫响应；蛋白质组学可检测候选基因编码蛋白的表达与定位，证实其功能活性；代谢组学则可比对野生型与HGT阳性菌株的次生代谢产物谱差异，解析植物来源基因对杀虫代谢产物合成的调控作用。多组学联合分析可为EEPF的毒力提升与功能优化提供分子层面的证据支撑。

挑战与展望

EEPF的实际应用仍面临多重挑战：环境敏感性（温度、湿度、紫外线、土壤条件）导致田间表现不稳定，制剂稳定性差、货架期短、存储要求高；非靶标效应风险（尤其直接孢子暴露场景）、监管流程复杂、农户接受度有限均制约其规模化推广。未来需从四方面突破：一是研发UV保护载体、控释系统等新型制剂技术，延长货架期与田间持效期；二是推广内生定殖作为递送策略，减少叶面喷施以降低非靶标暴露风险，将EEPF纳入IPM体系以保护有益节肢动物；三是开展多地点、多季节的田间试验，制定适配不同 agro-climatic 区的应用指南，推动监管机构针对微生物生物农药优化审批流程，配套农户培训与技术推广服务；四是依托多组学技术解析植物-真菌-昆虫互作网络、环境持效性与安全性机制，指导新一代EEPF产品的理性开发。

结论

EEPF的应用代表了生物防治的概念革新，从体外施用微生物制剂转向植物体内的内生防御体系构建。EEPF的生态适应性、功能灵活性与生物学广谱性使其可在多样环境背景下与不同植物和害虫互作，这种适应性可能由水平基因转移与代谢产物信号调控共同强化，使其区别于传统虫生真菌，成为持效性的系统级害虫管理工具。EEPF基因组中植物来源基因的发现为理解杀虫性状的演化获取提供了框架，也为非转基因策略的菌株改良指明了方向。微生物学、生物技术及多组学手段的进步为可控、可预测的EEPF开发利用创造了条件，将EPF维持在内生状态而非反复人工继代，有助于保留易退化的毒力、代谢能力与寄主适应性状。未来EEPF的发展并非完全替代化学农药，而是重构作物保护范式，使适应性微生物盟友成为生物集成作物保护体系的核心组成部分，最终推动农业系统的可持续性转型。