《Archives of Toxicology》：Electronic cigarette aerosols disrupt airway barrier function via MMP-dependent E-cadherin cleavage: findings from cell culture and murine models
编辑推荐：
电子香烟（e-cigarette，电子烟）的使用率持续上升，但其吸入气溶胶损害气道上皮完整性的毒理学机制仍不明确。E-钙黏蛋白（E-cadherin，上皮细胞黏附连接的关键蛋白，维持上皮凝聚力）可发生蛋白水解切割产生可溶性E-钙黏蛋白（soluble E-ca
电子香烟（e-cigarette，电子烟）的使用率持续上升，但其吸入气溶胶损害气道上皮完整性的毒理学机制仍不明确。E-钙黏蛋白（E-cadherin，上皮细胞黏附连接的关键蛋白，维持上皮凝聚力）可发生蛋白水解切割产生可溶性E-钙黏蛋白（soluble E-cadherin，sE-cad），是上皮屏障功能障碍和炎症的介质。研究人员假设电子烟气溶胶暴露促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）依赖性的E-钙黏蛋白切割，导致sE-cad释放及上皮屏障破坏。研究人员采用分化的人原代正常支气管上皮细胞（normal human bronchial epithelial，NHBE）、16HBE细胞及小鼠全身体内暴露模型，使用可编程吸烟机产生生理相关气溶胶考察上皮损伤。体外研究使用含18 mg/mL尼古丁的Air Factory盐基烟油，体内暴露使用36 mg/mL。免疫印迹显示顶侧上清及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）中sE-cad水平升高。气溶胶暴露上调MMP-2、MMP-9及MMP-12的表达。电子烟气溶胶暴露显著降低跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance，TEER），增加FITC-葡聚糖通透性，破坏气道上皮屏障结构，表明屏障完整性及功能受损。MMP抑制剂非瑟酮（fisetin）预处理可减轻上述效应，保留屏障功能及连接蛋白定位。非瑟酮处理显著减少电子烟诱导的sE-cad释放，并使MMP-9表达明显降低，而MMP-2及MMP-12水平无改变，确定MMP-9为E-钙黏蛋白切割的关键介导因子。综上，本研究确立MMP依赖性的E-钙黏蛋白切割为电子烟诱导上皮屏障功能障碍的机制驱动因素，并提示sE-cad可作为气溶胶致气道损伤的潜在早期生物标志物及治疗靶点。
《Archives of Toxicology》论文解读：电子烟气溶胶通过MMP依赖性E-钙黏蛋白切割破坏气道屏障功能
一、研究背景与立项依据
气道上皮是抵御吸入性毒物、微生物及颗粒物的首道防线，其完整性依赖于紧密连接（tight junction，TJ）与黏附连接（adherens junction，AJ），其中E-钙黏蛋白（E-cadherin）是AJ的核心跨膜蛋白。既往研究表明电子烟暴露可降低跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）、改变连接蛋白定位并增加呼吸道病毒感染易感性，但其上游分子机制未明。在呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染模型中，E-cadherin经基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）介导的胞外域脱落生成可溶性E-钙黏蛋白（soluble E-cadherin，sE-cad），sE-cad可进一步破坏TJ稳定性并放大屏障损伤。尚无研究证实电子烟气溶胶是否诱导E-cadherin蛋白水解切割及sE-cad生成，亦未明确介导此过程的蛋白酶。基于此，研究人员假设电子烟气溶胶通过上调MMP活性促进E-cadherin胞外域切割，释放sE-cad，最终导致气道上皮屏障功能障碍。该研究旨在从细胞及动物水平验证此假说，并探讨MMP抑制的保护作用及sE-cad作为生物标志物的价值。论文发表于Archives of Toxicology。
二、主要关键技术方法
研究人员采用两种实验体系：（1）体外细胞模型：人支气管上皮16HBE细胞系及原代正常支气管上皮细胞（NHBE）于Transwell小室培养，NHBE在气-液界面（air–liquid interface，ALI）分化；使用ASL 5000呼吸模拟器按青少年模拟吸烟模式给予含18 mg/mL尼古丁盐的电子烟气溶胶或HEPA过滤空气，检测TEER、FITC-葡聚糖（FITC-dextran，3 kDa）旁细胞通透性及顶侧上清sE-cad/MMP；（2）体内小鼠模型：C57BL/6小鼠行全身体内暴露于含36 mg/mL尼古丁盐的电子烟气溶胶（SCIREQ inExpose系统，70 W，235 ℃，3口/分钟×60分钟/天×4天）或HEPA过滤空气，收集BAL液及肺组织；部分体外实验予MMP广谱抑制剂非瑟酮（fisetin，20 μmol/L）预处理。通过Western blot检测sE-cad、MMP-2/9/12、连接蛋白（ZO-1、occludin、E-cadherin、β-catenin）总蛋白量，免疫荧光观察连接蛋白膜定位，以一维ANOVA及Tukey事后检验进行统计学分析。
三、研究结果
E-cigarette aerosols increase sE-cad levels across multiple models（电子烟气溶胶在多种模型中升高sE-cad水平）
16HBE细胞经含尼古丁气溶胶暴露8 h及24 h后，顶侧上清中sE-cad（~60–80 kDa片段）较空气对照组显著升高；C57BL/6小鼠连续4天暴露于含尼古丁电子烟气溶胶后，BAL液中sE-cad水平亦显著高于空气对照组（Western blot及光密度分析，p<0.05~0.0001）。结果表明电子烟气溶胶可在体外及体内促进膜结合E-cadherin的蛋白水解切割及sE-cad释放。
E-cigarette exposure induces increased expression and secretion of MMP-2, MMP-9, and MMP-12（电子烟暴露诱导MMP-2、MMP-9及MMP-12表达及分泌增加）
ALI培养的NHBE细胞经电子烟气溶胶暴露后，顶侧上清中MMP-2、MMP-9的前体及活化形式及pro-MMP-12均升高；小鼠BAL液中同样检出MMP-2、MMP-9前体/活化形式及pro-MMP-12上调（p<0.05~0.0001）。提示电子烟气溶胶可诱导气道上皮分泌MMP-2、MMP-9、MMP-12，为E-cadherin切割提供酶学基础。
E-cigarette exposure induces epithelial barrier dysfunction in 16HBE cells in vitro（电子烟暴露致16HBE细胞上皮屏障功能障碍）
含尼古丁气溶胶暴露使16HBE细胞TEER较基线显著下降，FITC-dextran旁细胞通量显著增加（p<0.0001）；20 μmol/L fisetin共处理显著恢复TEER并降低通透性（p<0.05~0.0001）。说明电子烟气溶胶损害上皮屏障完整性，且该损害可被MMP抑制剂部分逆转，支持MMP活性参与屏障破坏。
E-cigarette exposure alters TJ and AJ protein organization（电子烟暴露改变TJ及AJ蛋白空间组织）
免疫荧光显示电子烟气溶胶暴露后ZO-1、occludin（TJ蛋白）及E-cadherin、β-catenin（AJ蛋白）呈不连续、碎片化膜定位，空气对照组呈连续线性膜染色；fisetin处理可保留连接蛋白膜定位。全细胞裂解液Western blot显示各连接蛋白总蛋白量无显著变化。表明电子烟气溶胶主要通过干扰连接蛋白膜定位/细胞骨架偶联而非降低总蛋白表达来破坏屏障，且此过程部分由MMP介导。
MMP inhibition reduces e-cigarette–induced sE-cad release（MMP抑制减少电子烟诱导的sE-cad释放）
fisetin处理使气溶胶暴露后升高的顶侧上清sE-cad水平显著降低（p<0.01），同时选择性降低MMP-9表达（p<0.05），而对MMP-2及MMP-12水平无明显影响。证实E-cadherin切割为MMP依赖性，且MMP-9是该过程中关键的介导亚型。
四、讨论与结论翻译
讨论要点总结：本研究揭示电子烟气溶胶通过上调MMP（尤MMP-9）促进E-cadherin胞外域脱落生成sE-cad，引起AJ/TJ错位及旁细胞通透性增加，确立MMP–E-cadherin轴为电子烟致气道上皮损伤的新机制。sE-cad有望作为电子烟相关上皮亚临床损伤的血清/尿液可检测生物标志物。非瑟酮选择性下调MMP-9并减轻屏障破坏，但广谱MMP抑制剂临床毒性限制其应用，未来可探索靶向MMP-9或上游信号（如NF-κB、AP-1、尼古丁受体）的策略。研究局限性包括未设无尼古丁气溶胶对照、未直接测MMP酶活性、未探讨sE-cad自身功能及C端片段γ-分泌酶切割、使用单一设备及急性暴露条件等。
结论（原文翻译）：
电子烟气溶胶通过MMP介导的E-钙黏蛋白（E-cadherin）切割、sE-cad生成增加、黏附连接（AJ）及紧密连接（TJ）组织破坏以及上皮通透性异常，诱导" leaky（渗漏型）"上皮屏障。这些发现揭示了电子烟相关气道损伤此前未被认识的致病机制，提示MMP活性及E-cadherin胞外域脱落是屏障功能障碍的核心驱动因素。sE-cad可作为潜在生物标志物，针对MMP的干预措施逆转屏障缺陷值得进一步研究。尚需明确上游信号通路、在人体队列中验证sE-cad及评估持续E-cadherin切割对气道生理的长期影响。
