《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases》：Performance evaluation of the BioFire respiratory panel 2.1 plus and exploratory analysis of Ct values for respiratory pathogen quantification
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背景：BioFire FilmArray RP2.1 plus是一种综合征性多重PCR检测板，用于定性检测20种呼吸道病原体。BioMérieux最近推出了FIREWORKS软件平台，可提供扩增数据，包括周期阈值(Ct)值。目的：本研究评估了BioFire R
背景：BioFire FilmArray RP2.1 plus是一种综合征性多重PCR检测板，用于定性检测20种呼吸道病原体。BioMérieux最近推出了FIREWORKS软件平台，可提供扩增数据，包括周期阈值(Ct)值。目的：本研究评估了BioFire RP2.1 plus的诊断性能，并探讨了Ct值在病原体载量半定量评估中的潜在用途。方法：这项回顾性研究包含72份标本。其中部分标本经系列稀释用于定量分析，共产生130次PCR检测。标本在BioFire RP2.1 plus上检测，并与Xpert、Xpress Cov-2/Flu/RSV plus（Cepheid）或实验室内部实时PCR检测QuantStudio进行比较，共产生708个PCR结果。使用kappa系数进行定性一致性评估，并使用Passing-Bablok回归和Spearman相关性进行探索性分析。结果：BioFire RP2.1 plus与参比方法表现出极佳的定性一致性（kappa=0.963）。在130次检测中，117次一致。9次不一致的阴性结果涉及百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)（n=4）、冠状病毒NL63（n=1）、甲型流感病毒(Influenza A)（n=2）和乙型流感病毒(Influenza B)（n=2），主要出现在Ct值高（病原体载量低）的标本中。4份QuantStudio检测为阴性的标本被BioFire RP2.1 plus检出。探索性定量分析显示，BioFire Ct值与参比检测之间存在强相关性，Spearman系数分别为0.71（QuantStudio）和0.93（Xpert）。结论：总体而言，BioFire RP2.1 plus在呼吸道病原体检测方面与常规检测显示出高定性一致性。定量分析表明，BioFire来源的Ct值与参比方法之间存在可重复的关系，但鉴于探索性设计和跨平台比较的方法学局限性，应谨慎解释这些发现。
**研究背景与意义**
呼吸道感染性疾病是全球发病率和死亡率的主要原因之一，尤其在儿童、老年人和免疫功能低下患者中，是住院的重要原因。病毒每年导致超过4000万例报告呼吸道感染。这些感染常表现为咳嗽、发热、头痛和肌肉酸痛等非特异性症状，因此快速、灵敏和特异的诊断工具至关重要。特别是在严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）大流行期间，识别呼吸道病原体对患者管理和优化公共卫生应对措施至关重要。为满足这些临床需求，自动化多重实时聚合酶链反应（PCR）检测被开发出来，可同时从单份标本中检测多种呼吸道病原体。例如，Xpert Xpress CoV-2/Flu/RSV plus检测可区分SARS-CoV-2、甲型和乙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒（RSV）。其他综合征平台如BioFire呼吸道检测板2.1 plus，可检测16种病毒和4种细菌。瑞士洛桑大学医院（CHUV）微生物科分子诊断实验室开发了内部高通量分子诊断实时PCR平台（称为“QuantStudio”），用于检测上述病毒和细菌。尽管PCR检测常用于呼吸道病原体的定性检测，但在COVID-19大流行期间，利用Ct值估计病毒载量对于评估传染性、疾病严重程度和治疗反应非常重要。Ct值被用于追踪SARS-CoV-2感染动力学并改善患者管理。然而，Ct值在不同平台间存在变异性，且尚无标准方法将BioFire RP2.1 plus试剂盒中的Ct值转换为病原体载量。一些研究表明，巢式PCR的Ct值与常规RT-PCR检测之间存在线性相关性，使得研究BioFire Ct值在临床和研究中的潜在应用变得有意义。尽管已有研究比较了BioFire RP2.1 plus的定性性能，但尚未进行定量评估。在此背景下，本研究旨在评估BioFire RP2.1 plus的定性性能，并利用常规临床和质量控制标本探索BioFire来源的Ct值与参比分子检测之间的关系。该论文发表在《European Journal of Clinical Microbiology》。
**主要技术方法**
研究人员采用回顾性研究设计，纳入72份标本（包括15份质控样本、1份痰液、3份支气管肺泡灌洗液、1份咽拭子和52份鼻咽拭子或分泌物），部分经系列稀释后共进行130次PCR检测。标本分别使用BioFire RP2.1 plus、Xpert Xpress Cov-2/Flu/RSV plus（Cepheid）或实验室内部QuantStudio 7 Pro RT-PCR平台进行检测，共获得708个PCR结果。定性一致性通过kappa系数评估，定量探索性分析使用Passing-Bablok回归和Spearman相关分析。所有标本来自2022-2024年瑞士洛桑大学医院，匿名化处理，未获取临床数据。
**研究结果**
**BioFire RP 2.1 plus的定性性能**
共对72份标本进行了130次检测。与参比方法（SARS-CoV-2、流感病毒和RSV使用Xpert Xpress Cov-2/Flu/RSV plus，其他病原体使用QuantStudio 7）相比，总体一致性极佳，患病率校正偏差调整kappa（PABAK）系数为0.963。所有病原体的阴性百分比一致性（NPA）介于95-100%之间，阳性百分比一致性（PPA）波动于55-100%。9份标本在BioFire RP2.1 plus上未被检出（假阴性），包括冠状病毒NL63（1份，Ct 37.4）、甲型流感病毒（2份，Ct 37.5和37.1）、乙型流感病毒（2份，Ct 37.1和37.3）和百日咳鲍特菌（4份，Ct 29.7、30.8、37.9和41.2），其中7份为稀释后样本。排除稀释因素后，百日咳鲍特菌的PPA提高至62.5%。另有4份样本在QuantStudio 7上未检出但被BioFire检出（假阳性），包括冠状病毒HKU1（1份，Ct 22.9）、鼻病毒/肠道病毒（1份，Ct 20.8）、肺炎衣原体（1份，Ct 22.2）和RSV（1份，Ct 19.2），其中3份为稀释样本。
**BioFire RP 2.1 plus的定量评估**
通过比较BioFire RP2.1 plus与参比方法（QuantStudio和Xpert）的Ct值，发现两者高度一致：Spearman相关系数分别为0.71（QuantStudio）和0.93（Xpert）。Passing-Bablok分析显示恒定偏倚分别为-13.53（QuantStudio）和-14.19（Xpert），表明BioFire的Ct值低于参比方法，这是由于巢式PCR的双重扩增所致。针对每种病原体，对单份标本进行三个浓度稀释后检测，除百日咳副鲍特菌（Spearman系数0.5）外，其余病原体均显示强相关性（Spearman系数1.00）。但由于每病原体仅三个数据点，斜率和截距应视为指示性而非决定性。
**讨论与结论**
本研究首先评估了BioFire RP2.1 plus的定性性能，随后探索了BioFire来源Ct值的半定量潜力。结果显示，该检测与常规分子检测（Xpert Xpress和QuantStudio 7 Pro RT-PCR）具有高定性一致性，总体PPA达94.7%，PABAK系数0.963。假阴性主要出现在高Ct值（低病原体载量）样本中，尤其是百日咳鲍特菌，与其他研究结果一致。假阳性可能源于稀释样本或非鼻咽拭子标本类型的影响。定量分析表明，尽管存在恒定偏倚，BioFire Ct值与参比方法之间存在强相关性（Spearman系数0.71-0.93），提示通过标准化，可探索从Ct值推导病原体载量（拷贝/mL）的可能性。然而，Ct值受样本类型、提取效率和扩增化学因素影响，且BioFire针对某些病原体检测多个基因（如SARS-CoV-2的刺突和膜蛋白基因），可能引入变异性。本研究的局限性包括：回顾性设计、样本量较小、部分标本非鼻咽拭子、缺乏MERS-CoV阳性样本，以及巢式PCR与一步法qPCR的直接比较存在方法学限制。未来需在前瞻性研究中采用标准化定量方法进一步验证。
研究结论翻译：总体而言，我们的比较分析表明，BioFire RP2.1 plus与标准平台在呼吸道病原体检测方面具有高度一致性。此外，该系统通过Ct值显示出半定量分析的潜力，但需进一步验证，且通过实验室信息系统快速获取这些Ct值是必要的。将此类平台整合到临床工作流程中需要稳健的诊断管理策略，以确保合理使用、谨慎解读并改善对患者护理的影响。
