《Plant and Soil》：A novel transcription regulator of Azospirillum brasilense involved in plant–microbe interactions
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背景与目的：巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）发挥植物促生作用需要进行成功的植物定殖，然而调控该菌与植物互作的因子尚不清楚。方法：为探究这些关联，研究人员构建了靶向narL-like基因的巴西固氮螺菌FP2缺失突变株，该基因在定殖小
背景与目的：巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）发挥植物促生作用需要进行成功的植物定殖，然而调控该菌与植物互作的因子尚不清楚。方法：为探究这些关联，研究人员构建了靶向narL-like基因的巴西固氮螺菌FP2缺失突变株，该基因在定殖小麦根的细菌中高表达。随后研究人员表征了其在与禾草互作中的作用，并将新突变株的表型与ΔflcA株进行了比较，由于flcA基因位于narL-like基因附近，比较指标包括生物固氮（biological nitrogen fixation）、絮凝（flocculation）、刚果红结合能力、根定殖及植物促生能力。结果：ΔflcA和ΔnarL-like株系结合刚果红的能力低于FP2，提示这些突变株的表面多糖组成发生了改变。有趣的是，ΔnarL-like在小麦和狗尾草（Setaria）上的表生定殖群体更高，且黏附于玉米根系的群体也高于野生型菌株。结论：研究结果支持推测的NarL-like应答调控因子参与巴西固氮螺菌与小麦、玉米及狗尾草的互作，并在该菌的植物互作中具有重要性。这是首次报道narL-like基因的功能表征。
该研究聚焦于植物促生细菌（plant growth promoting bacteria, PGPB)巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）与宿主植物互作的分子调控机制。巴西固氮螺菌是研究最为深入的PGPB之一，被视为植物-细菌互作的模式系统，其通过生物固氮、植物激素合成、铁载体产生、磷酸盐溶解化及诱导植物耐受非生物和生物胁迫等多种机制促进植物生长。在这些机制中，通过生物固氮向宿主植物提供氮素以及合成吲哚乙酸（indoleacetic acid, IAA）被认为是该菌促生作用的最主要因素。然而，巴西固氮螺菌要发挥这些有益效应，必须实现对目标植物的有效定殖，因此亟需深入探究参与植物定殖的因子以改进接种技术。
化学趋向性和运动性已被证实是该菌根定殖的重要因素。该菌具有极强的运动能力，对有机酸、糖类、氨基酸、芳香族化合物及根系分泌物等多种诱引剂表现正趋化性。除运动性外，极性鞭毛对于根表弱黏附也必不可少，极性鞭毛的丧失会完全消除其黏附小麦根的能力。该菌对植物根的附着被认为是一个两阶段过程：第一阶段为初级吸附阶段，特征是由极性鞭毛介导的弱而可逆的黏附；第二阶段为次级锚定阶段，涉及细胞聚集体的形成以及由胞外多糖介导的牢固而不可逆的附着。此外，细菌细胞表面多糖如胞外多糖（exopolysaccharides, EPS）、脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）及胞外蛋白也与根定殖密切相关。例如，与EPS生物合成相关的noeL基因破坏会削弱该菌的聚集和生物被膜形成能力；缺乏dTDP-鼠李糖生物合成的突变株因LPS核心结构改变而影响玉米根定殖；主要外膜蛋白（major outer membrane protein, OmaA）具有暴露于细胞表面的结构域，可能参与该菌对根表的吸附。该菌细胞还能响应环境变化而改变形态和生理状态，在高氧、干燥及营养限制等胁迫条件下，细胞从自由游动状态转变为聚集状态，若代谢胁迫持续则进一步形成絮凝。絮凝过程受应答调控因子FlcA的调控，flcA突变株不能絮凝，也无法从运动营养细胞分化为"类囊肿"形式，且细胞表面缺乏胞外多糖物质。既往研究发现，在flcA敲除突变株中，与NarL同源的NarL-like蛋白表达量较野生型升高；而转录组分析进一步揭示，narL-like基因在定殖小麦的巴西固氮螺菌细胞中强烈表达，提示其为参与该菌与小麦互作的候选基因。基于此，该研究旨在对巴西固氮螺菌FP2株中的narL-like基因进行突变和表征，并将该突变株与flcA突变株进行比较分析。该论文发表于《Plant and Soil》。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：生物信息学分析，利用Artemis软件定位目标基因，通过Blastp进行序列比对，运用String软件分析蛋白互作网络，利用Pfam分析保守结构域；基因缺失突变技术，通过引物设计、PCR扩增、酶切连接、克隆至pK18mobsacb载体，再经三亲本接合转移至FP2株，利用卡那霉素正筛选和蔗糖负筛选获得缺失突变株，并通过PCR和测序确认；刚果红结合试验以评估表面多糖组成变化；体外乙炔还原法测定固氮酶（nitrogenase）活性；植物定殖和黏附试验，分别采用小麦（Triticum aestivum var. CD104）、玉米（Zea mays cultivar 2B512）及狗尾草（Setaria viridis A10）作为宿主植物，通过计数菌落形成单位（colony forming units, CFU）评估定殖能力；以及荧光标记和共聚焦显微镜观察，利用携带pME7134mob（表达dsRed）和pMP4655（表达egfp）质粒的菌株进行定殖可视化分析。
研究结果部分包含以下主要内容：
结构组织与生物信息学分析：通过Artemis软件在FP2株基因组注释组装中定位发现，flcA和narL-like基因均位于染色体上，且位置相邻、转录方向相同，中间隔有一个推测的应答调控因子开放阅读框。String软件分析未预测到narL-like与flcA之间存在功能互作，但提示可能存在菌株特异性或条件依赖性的调控关系。Pfam分析显示，NarL-like和FlcA蛋白均含有典型的双组分信号系统结构域，即N端REC（receiver）受体结构域和C端LuxR型HTH（helix-turn-helix）DNA结合结构域。NarL-like蛋白与大肠杆菌和铜绿假单胞菌等中的NarL应答调控因子具有结构相似性，但FP2基因组邻近区域未发现narX样组氨酸激酶基因，且缺失突变株在以硝酸钾为唯一氮源的培养基上依赖硝酸生长能力与野生型相当，表明该narL-like基因不参与硝酸盐代谢，仅表示与NarL家族应答调控因子的结构同源性。
固氮酶活性：虽然ΔnarL-like突变株的固氮酶活性（52 nmol乙烯·min
-1·mg蛋白
-1）较野生型（35 nmol乙烯·min
-1·mg蛋白
-1）有所增加，但差异未达统计学显著水平（t检验，p>0.05）；ΔflcA突变株的固氮酶活性水平接近野生型（约30 nmol乙烯·min
-1·mg蛋白
-1）。该结果提示在所测试条件下，基因缺失并未损害菌株的体外固氮能力。
絮凝和刚果红结合试验：野生型FP2和ΔnarL-like突变株在絮凝培养基中能够发生絮凝，而ΔflcA不能，且ΔnarL-like的絮凝程度较亲本FP2株增加。刚果红结合试验显示，野生型菌株形成暗红色、较干燥且表面粗糙的生长点，而ΔflcA和ΔnarL-like均形成鲜红色、表面光滑的生长点，其中ΔnarL-like颜色较ΔflcA更深。这些结果证实ΔnarL-like虽能絮凝但细胞表面多糖组成发生改变，与ΔflcA突变株类似但表型存在差异。
定殖和黏附试验：在小麦根表生定殖试验中，各时间点菌株间黏附细胞数无显著差异，但ΔnarL-like突变株在所有检测时间点的CFU均高于野生型FP2，从第3天起差异达统计学显著水平。在玉米根黏附试验中，ΔnarL-like在所有时间点均显示较高的根附着细菌数量，仅在接种后0天（黏附试验）达到统计学显著性；其表生群体在第5天和第7天也高于其他菌株，但未达统计学显著水平。在狗尾草定殖试验中，单独接种时ΔnarL-like突变株的单位根质量CFU在第3天高于野生型，且携带pMP4655质粒时差异显著。
荧光显微镜观察定殖情况：为直接观察ΔnarL-like突变株与野生型的根定殖差异，研究人员将表达荧光蛋白的菌株接种于狗尾草A10。共聚焦显微镜观察和CFU计数均证实，无论使用何种荧光质粒，ΔnarL-like突变株在第3天的定殖能力均优于野生型，红色荧光标记的ΔnarL-like菌株在根表呈现出更高密度的附着细菌。
讨论部分总结如下：研究人员指出，Pfam分析结果表明NarL-like蛋白与FlcA蛋白同属LuxR家族转录调控因子，含有REC受体结构域和HTH DNA结合结构域，是典型双组分信号转导系统的特征结构。双组分系统（two-component systems, TCS）是细菌响应环境刺激调控基因表达的主要机制之一，调控群体感应、次级代谢、生物被膜形成、运动性、毒力和抗生素抗性等关键过程。典型TCS由膜相连的感应组氨酸激酶（histidine kinase, HK）和胞质应答调控因子组成，HK检测刺激后自磷酸化并将磷酸基团转移至RR的REC结构域天冬氨酸残基，从而激活其功能。NarL-like作为可能的转录调控因子，且narL-like基因在巴西固氮螺菌与小麦互作时显著表达，提示该基因参与转录调控且可能与宿主植物互作相关。尽管NarL-like与FlcA具有相似的领域组织，但两者基因组区域均未发现组氨酸激酶基因，其磷酸化激活的刺激因素尚不清楚。
为深入理解narL-like基因的作用，研究人员构建了该基因及flcA的缺失突变株。ΔflcA和ΔnarL-like突变株结合刚果红能力降低、菌落颜色鲜红且表面光滑，提示这些突变株缺失或改变了外部多糖。ΔnarL-like突变株虽能絮凝但絮凝表型与ΔflcA相反且程度增加，表明两种转录调控因子以互补功能调控细胞壁组分的合成。虽然各菌株间固氮酶活性差异不显著，但ΔnarL-like株活性升高，这可能与胞外多糖改变细胞壁组成、促进氧扩散、创造有利于固氮酶活性的低氧条件有关。
研究结论指出，该研究结果支持flcA在巴西固氮螺菌中的作用，并为narL-like基因参与该菌与小麦、玉米和狗尾草的互作提供了证据，证明了这些基因在巴西固氮螺菌-植物互作中的重要性。据研究人员所知，这是首次报道NarL-like蛋白的功能，未来需要进一步研究以更好地表征这些突变株。研究数据表明，narL-like基因的缺失导致巴西固氮螺菌FP2株结合刚果红的能力和植物定殖特性发生改变，观察到的该突变株外部多糖组成变化可能促进了其对测试禾草的定殖增强效应。
