大西洋森林（Atlantic Forest）来源的刺孢小克勒霉（Cunninghamella echinulata）PA3S12MM产生新型耐热性L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）的生化特性表征

《Archives of Microbiology》：Biochemical characterisation of a new thermotolerant L -asparaginase produced by Cunninghamella echinulata PA3S12MM isolated from the Atlantic Forest

　　

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase，EC 3.5.1.1）是一类酰胺水解酶（amidohydrolase），可催化L-天冬酰胺（L-asparagine）水解生成L-天冬氨酸（L-aspartic acid）和氨（ammonia）。该酶在生物技术领域具有重要应用价值，既可作为抗肿瘤药物用于制药工业，也可用于降低食品工业中丙烯酰胺（acrylamide）的生成。本研究旨在筛选能够合成新型L-天冬酰胺酶的丝状真菌菌株，并对其进行生化特性表征。经平板检测和 submerged fermentation（submerged fermentation）筛选，研究人员确定刺孢小克勒霉（Cunninghamella echinulata）PA3S12MM菌株为具潜力的L-天冬酰胺酶产生菌。以5%（w/v）葡萄糖为碳源、0.4%（w/v）鸡羽毛（chicken feather）为农工氮源、发酵120 h条件下获得最高酶诱导量。该酶对L-天冬酰胺的表观米氏常数Km app为0.011 mmol L?1，表观最大反应速率Vmax app为126.5 mmol L?1 min?1。部分纯化后显示酶的最适反应条件为pH 7.0、温度85 °C。底物特异性方面，该酶对L-天冬酰胺的相对活性为100%，对L-谷氨酰胺（L-glutamine）为32.9%。β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）可增强酶活性，而Mn2?、L-半胱氨酸（L-cysteine）及二硫苏糖醇（DTT，dithiothreitol）则抑制其活性。上述结果表明，C. echinulata PA3S12MM是大规模制备新型真菌L-天冬酰胺酶的候选菌株，其生化特性提示其在制药及食品工业中均具应用潜力。

论文解读：《Archives of Microbiology》——Cunninghamella echinulata PA3S12MM产新型耐热L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）的生化表征研究

一、研究背景与意义

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase，EC 3.5.1.1）是一种酰胺水解酶（amidohydrolase），可催化L-天冬酰胺（L-asparagine）水解为L-天冬氨酸和氨，广泛用于急性淋巴细胞白血病（ALL，acute lymphoblastic leukaemia）治疗及食品中丙烯酰胺（acrylamide）的消减。目前临床用酶主要源于大肠杆菌（Escherichia coli）和欧文氏菌（Erwinia chrysanthemi），但存在过敏反应、血栓及胰腺炎等副作用；食品中常用的米曲霉（Aspergillus oryzae）等GRAS菌株酶活与耐热性有限。丝状真菌因高酶产量与环境耐受力被视为替代来源，但刺孢小克勒霉（Cunninghamella echinulata）所产L-天冬酰胺酶此前未见系统的生化表征报道。为此，研究人员从巴西大西洋森林（Atlantic Forest）分离筛选丝状真菌，对C. echinulata PA3S12MM菌株产的新型胞外L-天冬酰胺酶进行发酵优化与详尽的生化性质分析，以评估其工业与医药应用潜力。该论文发表于《Archives of Microbiology》。

二、主要关键技术方法

研究人员自大西洋森林（Nova Aurora, Paraná, Brazil）采集并保藏5株丝状真菌，以改良Czapek Dox平板（含酚红指示剂）检测水解晕圈计算酶指数（Enzyme Index, EI＝Halo Diameter／Colony Diameter）初筛，液体 submerged发酵复筛选定C. echinulata PA3S12MM。通过单因素实验优化碳源（包括多种农工废弃物）与氮源（包括鸡羽毛等）以最大化酶产量。粗酶液经Sephacryl S?100 hr与S?200 hr凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography）部分纯化，SDS?PAGE检测纯度。采用奈斯勒试剂（Nessler's reagent）比色法测定酶活（定义：每分钟释放1 μmol NH?为1 U），Bradford法测蛋白浓度。分别测定温度（30–100 °C）与pH（3.0–8.0，柠檬酸?磷酸缓冲液）对酶活及稳定性的影响；测试金属离子及化合物（EDTA、β?巯基乙醇、DTT等）的激活/抑制作用；以0.02–0.3 mmol L?1 L?天冬酰胺为底物通过Lineweaver?Burk作图求K_{m app}、V_{max app}；以L?天冬酰胺、L?谷氨酰胺、L?脯氨酸、甘氨酸进行底物特异性分析。数据以ANOVA及Tukey检验（p≤0.05）处理。

三、研究结果

Screening of L-asparaginase producing fungi

五株大西洋森林来源真菌在含L?天冬酰胺和酚红的改良Czapek平板上均产生红色水解晕圈（氨致酚红变红），酶指数（EI）0.68–2.1；液体发酵中C. echinulata PA3S12MM酶活最高（4.79 U mL?1），故被选为研究对象。

Influence of carbon and nitrogen sources on L-asparaginase production

碳源筛选中5%（w/v）葡萄糖诱导酶活最高（约3.5 U mL?1）；氮源中以0.4%（w/v）鸡羽毛（农工废弃物）诱导最强（5.14 U mL?1），其次为芦笋、胰蛋白胨和肉浸膏（各约4.2 U mL?1）。最终采用5%葡萄糖＋0.4%鸡羽毛＋基础Czapek培养基、28 °C静置120 h进行酶生产。

Purification of L-asparaginase

粗酶经Sephacryl S?100 hr再经S?200 hr凝胶过滤，比活由粗提液提升至89.3 U·mg?1，纯化倍数10.4倍，回收率仅0.2%；SDS?PAGE显示＜35 kDa多条带，表明为部分纯化酶。

Effect of temperature and pH on enzyme activity and stability

酶最适反应温度为85 °C，在85–95 °C保温180 min仍极稳定——90 °C孵育180 min残留94%活性，95 °C甚至有短暂热激活现象。最适pH为7.0（pH 8.0相对活性84.8%，酸性pH 4.0–6.0保留93.5%–99.3%活性）；pH稳定性测试显示pH 4.0–6.0孵育24 h保留较好活性（pH 6.0为74%），pH 3.0时降至50%。

Effect of ions and other compounds on L-asparaginase activity

β?巯基乙醇（还原剂）显著激活酶活（+72.1%）；10 mmol L?1 EDTA抑制51.4%，提示可能为金属酶（metalloprotein）；MnSO?（10 mmol L?1）完全抑制活性；DTT（10 mmol L?1）抑制87.8%；FeCl?与KCl亦呈负效应；其余测试离子影响较小。

Determination of kinetic constants and substrate specificity

对L?天冬酰胺的K_{m app}＝0.011 mmol L?1，V_{max app}＝126.5 mmol L?1 min?1。底物特异性：L?天冬酰胺设为100%，L?谷氨酰胺32.9%，L?脯氨酸与甘氨酸约75%（原文结果提及）。

四、讨论与结论总结

研究人员指出C. echinulata PA3S12MM是大西洋森林来源的新L?天冬酰胺酶产生菌株，其最适温度85 °C及95 °C下高热稳定性超越多数已报道真菌L?天冬酰胺酶，可能与半胱氨酸残基形成二硫键及金属配位有关。低K_{m app}（高底物亲和力）及较低谷氨酰胺酶（glutaminase）副活性符合药用酶减少副作用的优选标准，高热稳定性与鸡羽毛廉价氮源也利于食品工业高温加工中丙烯酰胺的消减。部分纯化回收率低提示后续需优化纯化策略或考虑酶固定化（immobilization）。

原文结论翻译：综上所述，本研究描述了大西洋森林野生菌株刺孢小克勒霉（Cunninghamella echinulata）PA3S12MM产生新型胞外L?天冬酰胺酶（L-asparaginase）及其特性表征。该酶表现出卓越的耐热性，最适活性达85 °C且在95 °C下具显著稳定性，优于许多已报道的真菌L?天冬酰胺酶。此外，成功利用鸡羽毛作为低成本氮源展示了该酶大规模生产的可持续途径。鉴于其高底物亲和力和热稳健性，该酶是进一步探究食品工业（特别是丙烯酰胺削减）及作为生物制药候选工具的重要对象。尽管当前生化数据为应用奠定了基础，但其向临床或工业转化的可行性尚需后续生物相容性及复杂体系性能评价研究加以验证。