《Biophysical Reviews》：Beyond sarcomere genetics: proteomic insights into hypertrophic cardiomyopathy
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肥厚型心肌病（HCM）长期以来被视为由编码肌节组成成分的致病性基因变异导致的典型单基因遗传病。然而，仅三分之一的HCM病例呈基因型阳性，加之疾病外显率不全、表型异质性显著等因素，均对这一简化认知提出了挑战。近年来，基于质谱的蛋白质组学技术取得进展，为深度解析人
肥厚型心肌病（HCM）长期以来被视为由编码肌节组成成分的致病性基因变异导致的典型单基因遗传病。然而，仅三分之一的HCM病例呈基因型阳性，加之疾病外显率不全、表型异质性显著等因素，均对这一简化认知提出了挑战。近年来，基于质谱的蛋白质组学技术取得进展，为深度解析人类HCM心肌提供了全新可能，正在重塑学界对HCM病理生物学的理解。本综述汇总了自上而下蛋白质组学与自下而上蛋白质组学研究的核心发现：HCM的特征是多个细胞区室发生广泛分子重构，涵盖肌节、肌质网、细胞骨架、线粒体及细胞核。现有研究共同支持一种模型——不同的HCM基因型会汇聚于共享的下游蛋白质组表型，同时凸显蛋白质组学是阐明疾病机制、调控因子及治疗靶点的有力工具。
引言
HCM是一种复杂且具有高度异质性的疾病，特征为左心室游离壁（常累及室间隔）肥厚，且无法用系统性高血压、主动脉瓣狭窄等异常负荷状态解释。该疾病在普通人群中的患病率约为1/500，部分研究提示真实患病率可达1/200。HCM患者常面临心力衰竭、心房颤动、室性心动过速等不良结局，也是年轻人猝死的常见病因。该病可发生于所有种族、性别与地理区域，但在女性和特定种族人群中可能存在漏诊情况。
早期家系研究揭示HCM呈常染色体显性遗传模式，多数致病基因编码肌节蛋白组分。首个被鉴定的HCM致病基因为编码肌节蛋白β-肌球蛋白重链的MYH7，随后TPM1（α-原肌球蛋白）、TNNT2（心脏肌钙蛋白T）等基因相继被发现，由此形成了“HCM是肌节疾病”的经典概念。后续更多肌节基因被鉴定，包括编码心室必需轻链（MLC-1v）的MYL3、编码调节轻链（MLC-2v）的MYL2、编码心脏肌钙蛋白I（cTnI）的TNNI3、编码肌球蛋白结合蛋白C的MYBPC3、编码α-心脏肌动蛋白的ACTC1、编码肌钙蛋白C（TnC）的TNNC1。这8个肌节基因致病性证据最充分，占基因型阳性HCM病例的90%以上，其中MYBPC3和MYH7变异最为常见，约占基因型阳性病例的80%。
近年经典的单基因致病假说受到多重挑战。首先，基因型阳性病例仅占已报道病例的三分之一。其次，即使携带明确致病性肌节基因变异的个体，疾病外显率也常不完全，表型可从严重HCM到无症状的基因型阳性表型阴性状态，纵向家系分析证实部分个体虽携带与患病家属相同的HCM基因型，却终生不发病，提示环境因素等其他调控因素参与疾病表达。第三，疾病的某些结构特征不符合单基因病预期，例如尽管突变蛋白呈均匀表达，但心室肥厚呈不对称分布。这些现象共同表明HCM的基因型-表型相关性较差，疾病表达可能受肌节外修饰基因（多基因性）、转录丰度或蛋白活性上游调控机制等多因素影响。
质谱（MS）蛋白质组学具备系统性分析疾病发病机制相关蛋白表达、蛋白质亚型多样性及翻译后修饰（PTMs）的能力，为解析HCM复杂分子机制提供了重要工具。一方面，随着HCM多基因性认知的不断深入，蛋白质组学可通过广谱筛选蛋白表达，识别参与疾病发病的失调通路，且相较于RNA测序，其不受转录-蛋白表达相关性有限的限制。另一方面，蛋白质的所有生物学功能均受蛋白质亚型调控，该术语用于描述由基因变异、可变剪接和翻译后修饰产生的多种蛋白种类，而翻译后修饰已被证实在病理性心肌肥厚和心力衰竭的发生发展中发挥关键作用。
蛋白质组学主要包含两种核心策略：自下而上蛋白质组学（BUP）与自上而下蛋白质组学（TDP）。BUP首先将蛋白质用胰蛋白酶等酶解为肽段，经液相色谱分离后进行质谱分析，通过肽段序列信息鉴定原始样本中的蛋白并确定相对丰度。该方法通量高、蛋白质组覆盖深度好，且数据分析软件成熟，但序列覆盖率有限，难以开展蛋白质亚型层面的分析，且存在“肽段到蛋白推断”的内在局限，导致映射序列变异和翻译后修饰时出现信息丢失与分子连接断裂。TDP则直接分析完整蛋白，可提供样本中蛋白质亚型的全景视图，虽然受完整蛋白溶解度、分离难度限制，通量和蛋白质组覆盖度相对较低，但非常适合蛋白质亚型分析，目前已发展出多种策略解决相关技术瓶颈。两类方法的应用为揭示HCM病理生物学中肌节外的蛋白与通路提供了关键支撑。
基于质谱蛋白质组学的HCM研究启示
TDP揭示了肌节、肌质网、细胞骨架、线粒体及核的失调蛋白质亚型
早期研究聚焦于肌节的蛋白质亚型改变。研究人员采用TDP全面表征了梗阻性HCM患者室间隔心肌切除术样本与非心衰对照的心肌肌节蛋白质亚型，依托高效色谱与高分辨率质谱的工作流程，解析出由可变剪接蛋白亚型与组合型翻译后修饰构成的复杂肌节蛋白质亚型图谱，检测范围除cTnT、cTnI、TnC、Tpm亚型、MLC-1亚型、MLC-2v、α-肌动蛋白亚型等主要肌丝组分外，还延伸至FHL2、ALP-H、elfin、cypher-5、cypher-6、calsarcin-1等多种Z盘蛋白，证实HCM的蛋白质亚型复杂性覆盖更广的肌节网络，超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱还可直接完成cypher-5、cypher-6、calsarcin-1的序列表征。
定量TDP分析显示，HCM室间隔样本与非心衰供体心脏相比，肌丝与Z盘蛋白的蛋白质亚型存在显著改变：cTnI、αTpm、MLC-2v的总磷酸化水平降低，而cTnT磷酸化水平升高；同时Enigma同源蛋白2（ENH2）的总磷酸化水平下降，且该变化与cTnI磷酸化降低呈线性相关。ENH2的磷酸化位点Ser118位于PKA磷酸化基序（RRXS/T）内，体外实验证实该位点可被PKA磷酸化，结合cTnI的已知PKA底物位点Ser22/23，提示HCM中存在PKA介导的信号通路失调。值得注意的是，上述蛋白质亚型改变与患者基因型无关，携带MYBPC3变异、MYH7变异及基因型未知的患者的改变模式高度相似，说明梗阻性HCM的不同基因型最终会在蛋白质亚型层面汇聚。
后续研究采用实验室开发的光裂解表面活性剂结合序贯提取策略，将检测范围扩展至约2000种蛋白质亚型，覆盖肌节、肌质网、细胞骨架、线粒体、细胞核等多个细胞区室。定量TDP分析再次验证了cTnI、αTpm、MLC-2v磷酸化降低与cTnT磷酸化升高的特征，同时检测到Z盘牵张感知复合体的核心组分肌肉LIM蛋白（MLP）磷酸化在晚期梗阻性HCM患者中显著升高。肌节外层面，肌质网蛋白受磷蛋白磷酸化降低，肌动蛋白结合蛋白cofilin-1与cofilin-2磷酸化升高，结合cTnI、ENH2的变化，进一步支持晚期HCM中PKA信号通路失调。
线粒体蛋白中可检测到多种琥珀酰化修饰亚型，包括线粒体苹果酸脱氢酶（MDH2）与线粒体ATP酶的多个组分，且这些蛋白的琥珀酰化水平在HCM患者中显著降低。琥珀酰化是将琥珀酰基团添加到赖氨酸残基ε-氨基的翻译后修饰，主要由线粒体中的SIRT5调控，既往研究显示SIRT5缺失小鼠会出现类似HCM的表型，而过表达SIRT5的小鼠可抵抗主动脉缩窄诱导的不良重构，本研究首次在人类HCM中证实了线粒体蛋白琥珀酰化的改变。
研究还检测到大量组蛋白亚型，存在甲基化、磷酸化、乙酰化的单一或组合修饰，涵盖全部4种核心组蛋白家族（H2A、H2B、H3、H4）及2种H1连接组蛋白亚型。尽管组蛋白丰度较低限制了修饰位点的精确定位，但仍观察到H2AC20核心组蛋白与H1-0连接组蛋白的整体乙酰化水平在HCM中降低。组蛋白乙酰化通常通过改变染色质结构或招募调控蛋白促进基因激活，在心肌肥厚的表观遗传重构中发挥重要作用，该结果为理解HCM的表观调控异常提供了初步线索。
BUP揭示了代谢功能障碍与肥厚通路激活
能量缺陷是HCM的标志性特征，既往研究认为该现象源于肌节ATP利用低效，导致其他关键细胞功能的能量维持能力不足。BUP研究为此提供了新视角：对基因型阴性、MYBPC3变异、MYH7变异三类HCM患者的手术样本与对照进行分析，共鉴定出至少1组HCM与对照存在差异的蛋白88种，三组HCM均与对照存在差异的蛋白57种。差异表达蛋白中线粒体与代谢相关蛋白显著下调，包括线粒体脂肪酸β-氧化相关的极长链酰基辅酶A脱氢酶ACADV、羟基酰基辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A酰基转移酶2，以及可逆催化ATP与磷酸肌酸之间磷酸转移的肌酸激酶M型（表达量降低43%）。蛋白质组层面的线粒体功能障碍证据与氧化代谢组分减少一致，配对代谢组分析也证实长链酰基肉碱、乙酰辅酶A、ATP、磷酸肌酸耗竭。上述改变同样独立于患者基因型与性别，提示HCM的能量代谢不足并非单纯由高收缩性肌节的能量需求增加导致，而是线粒体氧化能力与能量储备在蛋白层面的损伤驱动了代谢底物从高效的脂肪酸氧化向能量效率更低的途径转换，即HCM心脏本身的ATP生成存在缺陷，线粒体是能量不足的核心参与者。
另一项针对43例基因型阳性与33例基因型阴性HCM患者的BUP分析显示，基因型阳性与基因型阴性HCM的主成分分析无分离，再次证实不同基因型的HCM蛋白质组特征高度相似。HCM与对照相比约有411种蛋白（占定量蛋白质组的9%）差异表达，涉及代谢与肥厚信号通路。值得注意的是，6条经典肥厚通路（ERK5信号、ERK/MAPK信号、HER-2信号、内皮素-1信号、PI3K/AKT信号、UVA诱导的MAPK信号）在蛋白层面上调，而配对转录组分析显示其中5条通路在转录层面下调，凸显了HCM这类复杂疾病中蛋白水平分析的必要性。磷酸化蛋白质组分析显示，HCM中372种蛋白磷酸化降低，880种蛋白磷酸化升高，其中RAS-MAPK通路的多个组分呈高磷酸化状态，结合多条肥厚通路最终汇聚于RAS-MAPK信号级联的现象，提示该通路是晚期HCM的共同终末通路。
总结与展望
HCM作为肌节编码基因致病性变异导致的典型单基因病的传统范式，已不足以解释患者群体的临床与生物学异质性。基于质谱的蛋白质组学研究充分证实，HCM存在跨越肌节、肌质网、细胞骨架、线粒体、细胞核多个细胞区室的广泛分子重构，且这些蛋白质组改变在不同基因型患者中高度一致，提示晚期HCM无论初始遗传损伤为何，最终都会汇聚于共享的下游分子表型。
研究团队开展的TDP研究揭示了肌节与肌节外蛋白的蛋白质亚型与翻译后修饰协同失调，涉及激酶信号改变、琥珀酰化介导的线粒体蛋白调控及表观遗传重构；互补的BUP研究进一步证实线粒体氧化代谢广泛抑制是HCM能量不足的主要来源，且肥厚信号通路被激活。这些发现共同强调了蛋白水平调控在塑造HCM复杂临床表型中的核心作用。
未来，自上而下蛋白质组学将在推进HCM病理生物学认知、衔接临床表型与患者基因型方面发挥独特优势。持续应用高分辨率蛋白质组技术，尤其是与多组学、空间分辨技术联合，将为定义疾病修饰因子、识别肌节外的治疗靶点、最终优化HCM精准医疗策略提供关键支撑。
