羧甲基化β-葡聚糖（源自Pichia kudriavzevii M16）：结构表征与多功能生物活性

《Folia Microbiologica》：Carboxymethylated β-glucan from Pichia kudriavzevii M16: structural characterization and multifunctional bioactivity

　　

在本研究中，研究人员从益生酵母菌株Pichia kudriavzevii M16的细胞壁中获取β-葡聚糖（β-gluM16），并通过羧甲基化（CMβ-gluM16）对其进行化学修饰，以提高其水溶性。利用凝胶渗透色谱法测得CMβ-gluM16的分子量为232 kDa。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认了结构修饰，光谱位移与羧甲基官能团相关。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基和超氧阴离子清除实验评估抗氧化活性。在100 mg/mL浓度下，DPPH活性达到96%，羟基自由基清除率达69.65%，超氧阴离子清除率逐渐达到76%。CMβ-gluM16有效减少了所有测试病原菌的生物膜形成。对大肠杆菌（Escherichia coli）的抑制作用最强（1 mg/mL时抑制80%），其次是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，0.5 mg/mL时抑制71%）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，10 mg/mL时抑制67%），具体取决于应用浓度。细胞毒性实验显示，L929成纤维细胞在500 μg/mL浓度下处理36 h后仍保持存活（存活率≥64%），表明无毒性作用。然而，在同一浓度和时间下，HT-29结直肠腺癌细胞存活率呈剂量和时间依赖性降低，降至60%。CMβ-gluM16增强了植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LP1对肠上皮细胞的粘附，在500 mg/mL浓度下，粘附率从单独益生菌的83%提高到合生元应用的92%。研究人员评估了细胞因子（白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））水平以分析免疫调节活性；这些水平随剂量和应用时间变化。在测试条件下，IL-1β范围为1341至3371 pg/mL，IL-6范围为169至280 pg/mL，IL-10范围为220至859 pg/mL，TNF-α范围为126至263 pg/mL。本研究是对CMβ-gluM16潜在生物技术应用的初步探索，表明其具有进一步研究的价值。

研究背景：β-葡聚糖（β-glucan，一种由微生物产生并提取自细胞壁的多糖）在生物技术研究中应用日益广泛，但来源于酵母细胞壁的β-葡聚糖水溶性差，限制了其生物利用度。通过引入羧甲基（carboxymethyl）、磷酸根（phosphate）和硫酸根（sulfate）等官能团提高溶解度是重要的策略。已有研究表明，β-葡聚糖具有抗氧化、抗生物膜、抗肿瘤和抗炎等活性，并有助于改善肠道健康。然而，关于益生酵母菌株来源的β-葡聚糖经羧甲基化结构修饰后如何影响其生物活性的综合研究仍然有限，尤其缺乏在同一实验框架内同时评估抗氧化、抗生物膜、细胞毒性、粘附促进和细胞因子调节效应的研究。研究人员从潜在益生酵母Pichia kudriavzevii M16的细胞壁中提取β-葡聚糖（β-gluM16），通过羧甲基化提高其水溶性，并对其分子量和官能团进行表征；随后在不同浓度和孵育时间下评估了羧甲基化β-葡聚糖（CMβ-gluM16）的抗氧化、抗生物膜和细胞毒性效应，评价了其与植物乳植杆菌LP1组成的合生元制剂对肠上皮细胞粘附的增强作用，并考察了其对HT-29细胞系中细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）产生的免疫调节潜力。该论文发表在《Folia Microbiologica》。

主要关键技术方法：研究人员从Gazi大学生物系生物技术实验室的菌种保藏库获取酵母菌株P. kudriavzevii M16和乳酸菌L. plantarum LP1，病原菌（大肠杆菌ATCC 11229、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 25923）用于抗生物膜实验。人类结直肠腺癌细胞系HT-29（ATCC? HTB-38?）和小鼠成纤维细胞L929（ATCC?CCL-1?）用于细胞实验。β-葡聚糖提取采用自溶、热处理、机械破碎、脂质去除和蛋白酶处理等步骤；羧甲基化通过异丙醇分散、氢氧化钠活化、一氯乙酸醚化反应完成。结构表征采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和尺寸排阻色谱（SEC）测定分子量。生物活性评估包括DPPH、超氧阴离子和羟基自由基清除实验（抗氧化活性）、微量板结晶紫法（抗生物膜活性）、MTT法（细胞毒性）、光学显微镜观察（粘附能力）以及ELISA法（细胞因子水平测定）。

研究结果：

**CMβ-gluM16的结构表征**：FTIR分析显示，与天然β-gluM16相比，CMβ-gluM16在~1500和1416 cm^-1处出现新的吸收峰，归属于羧酸根（–COO^-）的不对称和对称伸缩振动，证实了羧甲基基团的引入；同时β-吡喃苷键在~921 cm^-1处的吸收峰依然存在，表明主链结构得以保留。SEC分析表明CMβ-gluM16的重均分子量（Mw）为232 kDa，数均分子量（Mn）为148 kDa，Z均分子量（Mz）为407 kDa，多分散指数（Mw/Mn）为1.56，显示较窄的分子量分布。

**CMβ-gluM16的抗氧化活性**：通过DPPH、超氧阴离子和羟基自由基清除实验评估。DPPH清除活性在5 mg/mL时达70%，100 mg/mL时达96%，IC₅₀值<0.2 mg/mL。羟基自由基清除活性在100 mg/mL时达69.66%，IC₅₀值<0.2 mg/mL。超氧阴离子清除活性在100 mg/mL时达76%，IC₅₀值约0.4 mg/mL。结果表明CMβ-gluM16具有较强且浓度依赖的抗氧化能力，且优于许多文献报道的天然或修饰β-葡聚糖。

**CMβ-gluM16的抗生物膜活性**：CMβ-gluM16在所有测试浓度（0.2–100 mg/mL）下均抑制病原菌生物膜形成，抑制率在57%–80%之间。对大肠杆菌抑制最强（1 mg/mL时80%），其次为铜绿假单胞菌（0.5 mg/mL时71%）和金黄色葡萄球菌（10 mg/mL时67%）。抑制作用在测试浓度范围内变化不大，提示主要干扰初始细菌粘附阶段而非成熟生物膜，且可能受革兰氏阴性菌与阳性菌细胞壁结构差异影响。

**CMβ-gluM16的细胞毒性**：在L929成纤维细胞中，所有测试浓度（12.5–500 μg/mL）和时间（12–36 h）下细胞存活率均≥64%，根据ISO 10993-5标准属于低细胞毒性，表明良好的生物相容性。在HT-29结直肠腺癌细胞中，细胞存活率呈浓度和时间依赖性降低，500 μg/mL处理36 h后降至约60%，显示出对癌细胞的选择性代谢抑制而非非特异性毒性。

**CMβ-gluM16的粘附能力**：单独应用L. plantarum LP1时粘附率为83%，粘附指数（ADI）为566（良好粘附）。与CMβ-gluM16合生元联用时，粘附率在50、200、500 mg/mL下分别增至85%、89%、92%，ADI值分别升至883、1140、1180。显微镜观察进一步证实了粘附增强效果，表明CMβ-gluM16可能通过多糖介导的桥接作用或改善细菌共聚集促进益生菌粘附。

**CMβ-gluM16的细胞因子水平**：在HT-29细胞中，CMβ-gluM16处理对IL-1β水平有显著的时间依赖性影响（18 h: p=0.0203; 36 h: p=0.0005），低浓度时适度增加，高浓度时趋于减弱。IL-6水平呈显著浓度依赖性变化（p<0.0001），低至中等浓度降低IL-6分泌，高浓度相对升高。IL-10和TNF-α水平与对照组无显著差异。整体表明CMβ-gluM16发挥温和的免疫调节作用，未诱导强烈的促炎激活。

讨论与结论：讨论部分指出，羧甲基化通过提高水溶性和引入负电荷羧甲基基团，改善了功能性基团的可及性和电子/氢转移途径，从而增强抗氧化活性；同时增加的亲水性和表面电荷可能增强与微生物细胞表面及胞外聚合物（EPS）的静电相互作用，干扰生物膜形成。细胞毒性差异表明对正常细胞低毒而对癌细胞有选择性抑制作用。粘附增强可能涉及多糖介导的桥接和表面修饰。细胞因子谱显示平衡的免疫调节作用。结论部分翻译如下：羧甲基化将来源于Pichia kudriavzevii M16的天然β-葡聚糖转化为具有功能性能的水溶性形式。CMβ-gluM16在不同抗氧化体系中表现出稳定的自由基清除活性，抑制病原菌早期生物膜形成，并增强合生元配方中益生菌对上皮细胞的粘附。抗氧化活性由低IC₅₀值（DPPH和羟基自由基<0.2 mg/mL，超氧阴离子约0.40 mg/mL）支持，生物膜抑制率根据菌株不同介于57%–80%。在HT-29细胞中，该聚合物以剂量依赖性方式调节炎症介质水平，未诱导过度的促炎反应，同时在正常成纤维细胞模型中保持可接受的存活率。结果表明，酵母来源β-葡聚糖的结构修饰可改变其理化特性并影响其在体外系统中的氧化还原行为、微生物互作和上皮细胞反应。然而，研究结果局限于细胞和生化实验，需要进一步研究明确构效关系、受体水平互作及体内相关性。尽管如此，CMβ-gluM16表现出的抗氧化、抗生物膜、粘附促进和细胞因子调节的综合特性表明，它可能是一种有前景的功能性生物聚合物，值得在胃肠道相关应用中进一步探索。