旋转淬灭非对称罗丹明荧光点亮适配体的定向进化

《Chemical Communications》：Evolving a fluorescent light-up aptamer for rotationally quenched asymmetric rhodamines

　　

荧光显微镜是研究生物分子在细胞环境中功能的关键技术。尽管核糖核酸（RNA）在细胞生物学几乎所有方面都发挥着核心作用，但用于活细胞可视化RNA的工具一直落后于为蛋白质成像开发的工具。这一差距主要源于缺乏遗传编码且自身荧光的RNA。基于蛋白质的RNA成像系统如MS2和PP7，以及近年发展起来的荧光点亮适配体（FLAPs）显著推进了RNA成像工具箱的发展。FLAPs将小分子荧光团（fluorophore）的荧光生成特性与融合到目标RNA的适配体的遗传编码能力相结合。

染料产生荧光的机制多种多样，包括荧光团二聚化、淬灭基团（quencher moiety）偶联、环境依赖的螺环化（spirocyclization）以及分子内运动。后一类机制中，特别关注染料分子内通过单键进行的旋转弛豫（rotational relaxation）。尽管具有潜力，这一机制的研究相对较少。近期研究将julolidine基荧光分子转子（fluorescent molecular rotor）与其结合伴侣Okra适配体联用，在绿光光谱范围内增强了基于FLAP的RNA成像，为现有的Broccoli和Pepper系统提供了更亮且更稳定的光照替代品。另一项使用橙红色荧光N-芳基取代磺基罗丹明的研究仅表现出适度的适配体亲和力，限制了高分辨率成像应用的进展。除FLAPs外，非对称罗丹明已被用作粘度敏感探针，并基于pH值靶向线粒体和溶酶体等细胞器。

超分辨率成像技术用罗丹明结合适配体（RhoBAST）是一种性能卓越的FLAP，以其光稳定性、高亲和力和亮度著称，适用于活细胞中超分辨率RNA成像。其对多种呫吨（xanthene）基染料的广谱兼容性进一步增强了其在各种荧光原中的实用性。迄今，RhoBAST的荧光生成性已通过偶联淬灭剂、二聚化和螺环化实现。此外，其稳健性使其能与蛋白质结合适配体联合使用，扩展了可靶向生物分子的范围。

在本研究中，研究人员探索了基于限制罗丹明荧光团分子内运动（特别是旋转）的点亮策略。研究人员首先测试了修饰的罗丹明染料是否能被RhoBAST结合。为此，在四甲基罗丹明（TMR）的一个外环胺上引入苯环，得到非对称的苯基三甲基罗丹明（PhTMR）。这一结构修饰促进了旋转弛豫，使染料在溶液中被淬灭。体外实验中，与RhoBAST的结合有效抑制了N-C_aryl键周围的旋转，产生了（257 ± 5)倍的荧光增强。这一性能优于接触淬灭的TMR-DN（27倍）和基于螺环化的SpyRho（60倍）。然而，RhoBAST与PhTMR的结合亲和力，解离常数（K_D）为360 ± 13 nM，比TMR-DN（15 nM）和SpyRho（34 nM）弱10倍以上，表明需要通过再筛选改进适配体。

为此，研究人员进行了体外配体指数富集的系统进化技术（SELEX）实验，通过三乙二醇二胺（H₂N-(PEG)₂-NH₂）连接臂将PhTMR固定在NHS活化琼脂糖珠上。初始RNA文库是基于RhoBAST的掺杂版本，每个核苷酸位置以15%的突变率进行突变， resulted in约4 × 10¹⁴种序列的多样性。掺杂的RhoBAST序列两侧为用于扩增的恒定引物区域。在每轮筛选前，与仅连接连接臂的模拟树脂孵育以去除非特异性结合物。SELEX过程包括与固定靶标孵育、去除非结合物、洗脱结合物、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增和体外转录。经过六轮筛选后，从增加的洗脱RNA量和荧光激活可以看出富集效果。Sanger测序获得105个突变体，对其进行比对并分析每个位置的突变发生频率。结果显示在环L2和L3内的位置23、36和38处突变频率较高，与先前研究一致。通过对所有突变体进行二级结构预测，鉴定出41个具有RhoBAST样折叠的序列。突变量化和体外诱变突出了位置36作为关键位点。在该位置用嘧啶替换鸟嘌呤显著改善了亲和力：G36U突变体显示K_D为247 ± 23 nM，G36C突变体表现出K_D为115 ± 7 nM，比亲本RhoBAST（360 ± 13 nM）或G36A突变体（384 ± 22 nM）好三倍以上。值得注意的是，G36C突变体实现了309倍的卓越荧光增强，分别超过先前基于SpyRho和TMR-DN的RhoBAST系统5倍和11倍。

位置36的重要性与RhoBAST结合TMR-DN和SpyRho的近期晶体结构一致，这些结构揭示了具有半开放结合口袋的A样结构。具体而言，G18-A35-A28形成口袋的底部，而呫吨核心堆积在A22-A40上。这些位置的低突变率表明结构保守性。相比之下，包裹染料的G36-U39转角区域高度可变，允许在不破坏整体折叠结构的情况下进行适应性变化。RhoBAST^G36C:PhTMR在生理学相关的镁离子浓度下显示出高荧光强度，其激发（574 nm）和发射最大值（606 nm）与标准荧光显微镜设备兼容。

在成功筛选出针对苯基取代罗丹明的RhoBAST^G36C后，研究人员旨在通过合成具有不同芳基部分的探针来扩展染料范围。这些变体旨在探测电子和空间效应如何影响性能。为简化衍生化，不同的芳基取代基在最后合成步骤中引入。具体而言，合成了非对称溴代罗丹明核心，随后通过锌介导的亲核芳香取代或Buchwald-Hartwig偶联转化为芳基取代探针。这产生了九种衍生物。所有衍生物表现出可比的吸收和发射最大值。如先前观察到的，罗丹明衍生物与适配体的结合导致激发和发射最大值均向更高波长的 bathochromic 位移（Δbatho.ex 6–36 nm，Δbatho.em 6–30 nm）。值得注意的是，较大的Stokes位移允许标准荧光显微镜设备良好分离激发光和发射光。

虽然先前点亮罗丹明的螺环化受3位电子缺乏取代基的影响，但本研究调查了各种芳基残基对螺内酯化（spirolactonization）的影响。以半最大吸收时水-二氧六环溶剂混合物的介电常数表示的D₅₀值 strongly 依赖于取代基的电子性质。给电子基团使平衡向醌式形式移动，导致较低的D₅₀值；而吸电子基团有利于螺内酯形式，产生较高的D₅₀值。这些D₅₀值与取代基的Hammett参数（σ）相关。

研究人员随后评估了与RhoBAST^G36C相互作用时的荧光增强。衍生物5-7、11和12显示出最小的增强，被排除在进一步分析之外。其余衍生物表现出超过140倍的荧光增强，超过了前代系统RhoBAST:TMR-DN（26倍）和RhoBAST:SpyRho（60倍）的性能。最有前景的衍生物在体外进一步表征。通过固定浓度荧光团（50 nM）与不同适配体浓度滴定测量荧光增加来确定解离常数（K_D）。获得的K_D值揭示，增加取代基大小以及增加D₅₀值导致与RhoBAST^G36C的亲和力降低。将三乙二醇连接臂与胺和酰胺功能连接到4进一步增加了亲和力（PhTMR的K_D = 115 ± 7 nM）。这一趋势与先前报告一致，突出了连接臂偶联如何增强结合。量子产率测量表明，芳基取代罗丹明由于旋转弛豫的高效淬灭而在溶液中具有非常低的固有荧光。与RhoBAST^G36C的相互作用使量子产率增加了100倍以上，产生了高亮度。量子产率在水-甘油混合物中随粘度的线性依赖性支持了N-C_aryl键旋转控制弛豫的假设。最后，将PhTMR、4、8-10与从大肠杆菌（E. coli）分离的总RNA和蛋白质（牛血清白蛋白，BSA）的非特异性增强与RhoBAST^G36C的特异性增强进行了比较。由于PhTMR表现出最小的非特异性增强、高亮度、强结合亲和力（K_D = 115 nM）和出色的荧光增强（309倍），它被选定用于所有后续的体外和细胞应用。

利用RhoBAST^G36C:PhTMR系统的高荧光增强，研究人员建立了实时监测RNA合成的体外检测方法。使用编码RhoBAST^G36C或RhoBAST的DNA模板，每个携带T7启动子，在各自荧光原存在下进行T7聚合酶的体外转录。荧光的出现指示适配体的合成。作为阴性对照，正交硅罗丹明结合适配体（SiRA）在荧光原存在下被转录。RhoBAST^G36C:PhTMR优于RhoBAST:TMR-DN，显示出数量级更高的增强。

研究人员还展示了使用RhoBAST^G36C系统的活细胞RNA成像。在此，将适配体的单个重复序列融合到tRNA的反密码子环中。由此，在活细菌中实现了大肠杆菌tRNA的共聚焦成像。接下来，将同义适配体重复序列掺入表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒3'非翻译区，允许可视化活大肠杆菌中的GFP mRNA。共聚焦成像显示了GFP mRNA的明亮、特异性标记。作为阴性对照，使用不含适配体的相同质粒，仅产生PhTMR的微弱荧光信号。

研究人员确定了RhoBAST^G36C:PhTMR异常快速的交换动力学，通过停流光谱测定结合速率系数（k_a）为1.31 × 10⁸ M^?1 s^?1和解离速率系数（k_d）为29.7 s^?1。这些快速动力学比现有FLAP系统快数个数量级，使其成为单分子定位显微镜（SMLM）的有前景候选者。在100 nM染料浓度下，其闪烁间隔比其前代RhoBAST与TMR-DN或SpyRho短4-9倍，可能有助于SMLM超分辨率图像的更快获取。

利用芳基取代罗丹明的旋转淬灭，研究人员开发了具有卓越荧光增强的FLAP系统。研究人员阐明了此类罗丹明的结构和电子变异如何影响其性质。RhoBAST^G36C:PhTMR在活细菌中成像的证明能力以及快速交换动力学突出了其在先进应用中的潜力。

## 研究背景与问题

荧光显微镜是研究生物分子在细胞环境中功能的关键技术，然而RNA活细胞可视化工具长期落后于蛋白质成像工具，核心瓶颈在于缺乏遗传编码且自身荧光的RNA。尽管基于蛋白质的系统（如MS2、PP7）和荧光点亮适配体（FLAPs）已取得进展，但现有FLAP系统的荧光增强倍数和成像性能仍有提升空间。分子内旋转弛豫作为一种荧光淬灭机制，虽具潜力却研究不足。早前研究或光谱范围受限，或适配体亲和力不足，制约了高分辨率成像应用。开发基于旋转淬灭机制、具有高荧光增强倍数和快速动力学特性的新型FLAP系统，对于推进RNA活细胞成像技术具有重要意义。该论文发表于《Chemical Communications》。

## 关键技术方法

研究人员采用基于RhoBAST序列的掺杂SELEX文库（15%突变率，约4×10¹⁴序列多样性），通过PhTMR固定化（NHS-活化琼脂糖珠，H₂N-(PEG)₂-NH₂连接臂）进行六轮体外筛选；运用Sanger测序和二级结构预测分析突变体；通过定点突变验证关键位点；采用Buchwald-Hartwig偶联和亲核芳香取代合成芳基罗丹明衍生物；利用停流光谱测定动力学参数；在大肠杆菌中进行tRNA和GFP mRNA的活细胞共聚焦成像。

## 研究结果

**旋转淬灭PhTMR适配体的进化**：研究人员在TMR外环胺引入苯环获得PhTMR，其旋转弛豫导致溶液淬灭。RhoBAST与PhTMR结合可抑制N-C_aryl旋转，产生257倍荧光增强，但亲和力较弱（K_D=360 nM）。通过六轮SELEX筛选，发现G36位点为关键突变位点，G36C突变体（命名为RhoBAST^G36C）将亲和力提升至115 nM，荧光增强达309倍，远超前代系统。

**芳基取代罗丹明衍生物的结构-性能关系**：合成九种芳基衍生物探究电子和空间效应。给电子基团降低D₅₀值（15–22）， favor 醌式形式；吸电子基团升高D₅₀值（29–45）， favor 螺内酯形式。D₅₀与Hammett参数σ相关。增大取代基尺寸和提高D₅₀均降低适配体亲和力。三乙二醇连接臂显著增强结合。衍生物4、8–10表现出>140倍荧光增强。

**体外转录实时监测**：RhoBAST^G36C:PhTMR系统在T7聚合酶体外转录中实现实时监测，荧光增强幅度较RhoBAST:TMR-DN高一个数量级，SiRA适配体作为阴性对照无信号。

**活细胞RNA成像**：单拷贝RhoBAST^G36C插入tRNA反密码子环实现大肠杆菌tRNA成像；16个同义重复插入GFP mRNA 3'非翻译区实现mRNA可视化，特异性信号显著高于无适配体阴性对照。

**快速交换动力学特性**：停流光谱测定k_a=1.31×10⁸ M^?1 s^?1，k_d=29.7 s^?1，为现有FLAP系统最快速率之一。100 nM染料浓度下闪烁间隔较RhoBAST:TMR-DN或SpyRho短4–9倍。

## 讨论与结论

研究人员利用芳基取代罗丹明的旋转淬灭机制，成功开发了RhoBAST^G36C:PhTMR这一高性能力FLAP系统。研究揭示了结构和电子变异对非对称罗丹明性质的影响规律：旋转弛豫是主要淬灭机制，量子产率与粘度线性相关验证了该机制；适配体结合通过空间限制N-C_aryl旋转解除淬灭。G36位点的可塑性在维持整体折叠的同时优化了结合口袋，这是适配体工程的重要洞见。

该系统在活细菌RNA成像中的成功应用证明了其生物学适用性，而快速交换动力学特性尤为突出——k_a和k_d均显著优于现有系统，使其成为单分子定位显微镜的理想候选。短闪烁间隔可能实现更高时间分辨率的超分辨率成像，这是该领域的关键进展。

研究结论指出："利用芳基取代罗丹明的旋转淬灭，我们开发了具有卓越荧光增强的FLAP系统。我们阐明了此类罗丹明的结构和电子变异如何影响其性质。RhoBAST^G36C:PhTMR在活细菌中成像的证明能力以及快速交换动力学突出了其在先进应用中的潜力。"这一工作扩展了旋转淬灭机制在FLAP设计中的应用，为高亮度、快速动力学RNA成像工具的开发提供了新范式。