《JHEP Reports》：lnc122 RNA prevents liver tumorigenesis in MYC-driven liver cancer
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背景与目的：广泛研究表明，微RNA-122（miR-122）在肝脏稳态中发挥重要作用，其失调与肝癌和非酒精性脂肪肝等多种肝脏病理有关。miR-122的初级转录本——长链非编码RNA 122（lnc122）传统上仅被视为成熟miR-122的中间产物。方法：研究人
背景与目的：广泛研究表明，微RNA-122（miR-122）在肝脏稳态中发挥重要作用，其失调与肝癌和非酒精性脂肪肝等多种肝脏病理有关。miR-122的初级转录本——长链非编码RNA 122（lnc122）传统上仅被视为成熟miR-122的中间产物。方法：研究人员使用CRISPRi在肝细胞瘤细胞和小鼠肝脏中抑制lnc122 RNA表达（无论是否表达成熟miR-122 RNA），以确定lnc122 RNA是否具有独立功能。这些模型与RNA测序（RNAseq）、基因集富集分析（GSEA）、RNA下拉-质谱联用以及CRISPRi/CRISPRa介导的肝肿瘤模型相结合，用于阐明lnc122在肝脏稳态中的特定作用。结果：研究人员证明，lnc122 RNA具有独立的肿瘤抑制功能，与miR-122的抗增殖作用不同。具体而言，lnc122 RNA通过稳定MYC-UBR5 E3泛素连接酶蛋白复合物，促进MYC蛋白降解。与MYC的其他E3泛素连接酶不同，UBR5因与MYC在人类基因组上位置邻近，在超过40%的人类癌症中与MYC共扩增，而lnc122对于UBR5高效降解MYC不可或缺。配对的患者肝脏和肿瘤样本显示，肿瘤中lnc122 RNA浓度降低。此外，减少小鼠肝脏中的lnc122 RNA转录本会加剧MYC驱动的肝肿瘤发生。尽管lnc122表达仅限于肝脏，但在非肝转化细胞中外源表达lnc122也会使MYC蛋白不稳定。结论：研究人员的发现表明，lnc122 RNA与miR-122在监测和预防肝肿瘤发生中具有协同作用，可能成为治疗MYC驱动的人类癌症的新靶点。影响与意义：该研究表明，lnc122 RNA不仅是miR-122的前体，还通过UBR5形成泛素化复合物，负责限制MYC蛋白的半衰期。lnc122 RNA表达的缺失可能将其归类为肿瘤抑制基因，促进肝癌发生。开发增强该复合物活性的制剂可能为治疗肝细胞癌提供新的治疗方法。
## 论文解读：lnc122 RNA 在 MYC 驱动肝癌中的肿瘤抑制机制
### 研究背景与问题
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，MYC原癌基因的失调在约30%的肝癌及高达70%的人类癌症中发生。miR-122是肝脏中含量最丰富的微RNA，占肝脏总miRNA库的约70%，在脂质/胆固醇代谢和细胞增殖调控中起关键作用。其初级转录本lnc122传统上仅被视为miR-122生成的中间产物。然而，先前研究存在矛盾：miR-122种系敲除小鼠在老化过程中自发形成肝脏肿瘤，且lnc122水平升高；而抗miR-122反义寡核苷酸（ASO）治疗则改善肝脏脂肪变性，但未报道lnc122水平变化。这些不一致提示lnc122 RNA可能具有独立功能。此外，MYC蛋白半衰期极短（约30分钟），其降解主要通过E3泛素连接酶介导，其中UBR5因与MYC在染色体8q24和8q22上密切邻近而常被共扩增，但共扩增为何未能抑制肿瘤生长尚不清楚。因此，研究人员旨在探究lnc122 RNA是否在MYC蛋白稳态中发挥独立于miR-122的作用，并阐明其分子机制。
### 研究内容与主要结论
研究人员通过CRISPRi（CRISPR干扰）抑制lnc122 RNA表达，并结合miR-122回补实验，在肝细胞瘤细胞系和小鼠肝脏中系统解耦lnc122与miR-122的功能。研究证实，lnc122 RNA具有独立的抗增殖和肿瘤抑制功能：它通过物理结合MYC和UBR5 E3泛素连接酶，稳定MYC-UBR5蛋白复合物，促进MYC的多聚泛素化及降解。在小鼠MYC驱动肝癌模型中，抑制lnc122加速肿瘤形成，而激活lnc122则抑制肿瘤；即使在miR-122回补条件下，lnc122抑制仍导致肿瘤增多。配对患者样本分析显示，肝癌组织中lnc122水平显著降低，且伴随MYC转录活性升高。在非肝细胞（HeLa）中外源表达lnc122同样能降低MYC蛋白水平，且依赖UBR5。该研究发表于《JHEP Reports》。
### 关键技术与方法
1. **CRISPRi/CRISPRa系统**：利用dCas9-KRAB（抑制）或dCas9-VP64（激活）靶向lnc122启动子，调控其转录，并结合AAV8载体进行小鼠肝脏体内递送（来源：FVB/N小鼠）。
2. **RNA下拉-质谱联用（RNA Pulldown-MS）**：体外合成生物素标记的lnc122 RNA，与Huh7细胞核提取物孵育，经链霉亲和素磁珠捕获结合蛋白后进行质谱鉴定，发现UBR5等候选蛋白。
3. **RNA免疫沉淀（RIP）与共免疫沉淀（Co-IP）**：分别使用MYC抗体和UBR5抗体，结合RNase处理，检测lnc122 RNA与MYC、UBR5蛋白的物理互作及泛素化水平。
4. **体内肝癌模型**：通过水动力注射将Sleeping Beauty转座子（SB13）与MYC表达质粒（T3-cMYC）递送至小鼠肝脏，结合AAV介导的lnc122调控，评估肿瘤形成。
5. **RNA测序与GSEA**：对lnc122-/miR-122+ Huh7细胞进行RNA-seq，分析差异基因及通路富集，明确MYC靶基因集激活。
### 主要研究结果
**1. lnc122负调控Huh7细胞增殖**
- RNA FISH显示lnc122定位于Huh7细胞核，而HepG2细胞中不表达。
- 通过3'RACE鉴定lnc122存在poly(A)+和poly(A)-两种转录本，剪接形式两者比例相似，未剪接形式以poly(A)-为主。
- CRISPRi抑制lnc122导致细胞增殖加速；过表达野生型、种子突变型或polyA替代型的lnc122均抑制增殖，而miR-122单独过表达也抑制增殖。
- 建立lnc122-/miR-122+ Huh7稳定细胞系（通过CRISPRi抑制lnc122并回补miR-122），该细胞系增殖仍快于对照，证实lnc122具有独立抗增殖功能。
**2. lnc122调控MYC蛋白稳定性而非mRNA水平**
- GSEA分析显示lnc122抑制后MYC靶基因集显著激活。
- qRT-PCR和RNA-seq均显示MYC mRNA水平无变化，放线菌素D处理下mRNA稳定性相似。
- 环己酰亚胺（CHX）处理后，过表达lnc122的细胞中MYC蛋白降解更快，而lnc122-/miR-122+细胞中MYC蛋白更稳定。miR-122对MYC蛋白稳定性无影响。
**3. lnc122与MYC及UBR5物理互作**
- RIP-qPCR检测到内源性MYC蛋白复合物中富集lnc122 RNA，甲醛交联下仍可检测，但UV交联下丢失，提示间接互作或通过双链区域。
- RNA下拉-MS鉴定出288个候选结合蛋白，其中UBR5是已知的MYC E3泛素连接酶。
- Co-IP证实内源性MYC与UBR5互作，MG132处理可增强检测信号。
**4. lnc122组装MYC-UBR5蛋白复合物促进MYC泛素化**
- 免疫荧光显示MYC和UBR5共定位于细胞核。
- siRNA敲低UBR5增加MYC蛋白水平并减少MYC泛素化。
- RNase处理破坏MYC-UBR5互作；lnc122-/miR-122+细胞中MYC-UBR5互作和MYC泛素化均减弱，回补lnc122可恢复；过表达UBR5在lnc122缺失时无法增强互作或泛素化。
- 小鼠lnc122虽序列不保守，但同样能结合MYC并促进其降解，提示结构保守性比序列更重要。
**5. lnc122抑制加剧体内MYC驱动肝肿瘤形成**
- AAV-CRISPRi抑制lnc122（同时降低miR-122）使肿瘤面积显著增加；AAV-CRISPRa激活lnc122抑制肿瘤。
- 在miR-122回补的lnc122抑制肝脏中（lnc122-/miR-122+），肿瘤仍多于对照，明确lnc122的体内抑瘤作用独立于miR-122。
- 配对患者样本qRT-PCR和公共数据集GSE77509分析均显示肝癌中lnc122水平降低，且MYC转录活性升高。
**6. lnc122在非肝细胞中也具有功能**
- HeLa细胞中外源表达lnc122（野生型、种子突变型、polyA替代型）均抑制增殖、降低MYC蛋白水平，且依赖UBR5。
- lnc122表达增强内源性UBR5-MYC互作及MYC泛素化，RNase处理减弱互作。
### 讨论与结论
研究人员提出，lnc122 RNA通过作为分子支架，促进UBR5与MYC的物理互作，从而加速MYC蛋白泛素化降解。这解释了为何UBR5与MYC的共扩增未能抑制肿瘤——因为UBR8降解MYC需要lnc122作为必需辅因子。lnc122的丢失导致MYC蛋白稳定化，促进肝癌发生。该功能在进化上保守，尽管人和小鼠lnc122序列差异大。此外，lnc122可能还参与昼夜节律调控的脂质代谢。结论部分指出：lnc122 RNA与miR-122在监测和预防肝肿瘤发生中具有协同作用，可能成为治疗MYC驱动癌症的新靶点。未来可设计lnc122模拟物或小分子增强UBR5-MYC复合物活性，为肝细胞癌提供新疗法。
