来自金黄色葡萄球菌的一对密切相关的超氧化物歧化酶同工酶显示不同的稳定性和质子交换动力学

《Journal of Biological Chemistry》：A closely related pair of superoxide dismutase isozymes from Staphylococcus aureus show distinct stabilities and proton-exchange dynamics

　　

由氨基酸序列迭代突变引起的生化特性变化是蛋白质功能随时间变化的基础，这些变化支撑着进化过程。一个例子是酶对其催化辅因子从一种必需金属向另一种必需金属的依赖转变。研究人员此前描述了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的这种新功能化（neofunctionalisation），它使一种超氧化物歧化酶（SOD）从祖先的锰依赖性超氧化物歧化酶（MnSOD）转变为现有的可同等利用锰或铁的同工酶，称为铁锰兼用型超氧化物歧化酶（camSOD）。然而，尚不清楚camSOD的出现是否仅涉及辅因子灵活性的选择，还是在新功能化过程中其他生化特性也发生了分化。在此，研究人员研究了金黄色葡萄球菌SOD的一个独立生化特性——其结构稳定性。研究人员证明，新功能化的camSOD相对于祖先MnSOD表现出更高的稳定性。金黄色葡萄球菌camSOD在体外对化学和热变性更具抵抗力。关键是，虽然两种同工酶在其折叠核心处都有一个稳定的“核心”，该核心由围绕金属辅因子的蛋白质区域组成，这些区域在暴露于同位素标记溶剂时抵抗氢-氘交换，但camSOD中的这个核心比MnSOD更大且更抗交换。因此，在这对SOD的近期分化过程中，两个不同的生化特性经历了显著而快速的进化变化。这项研究为探究这些特性（SOD的金属偏好与稳定性）之间的结构和功能关系，以及这些特性如何在金黄色葡萄球菌谱系的新功能化过程中被同时选择奠定了基础。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是一类关键的抗氧化酶，生物体中存在多种金属依赖形式，包括锰依赖性SOD（MnSOD）、铁依赖性SOD（FeSOD）以及可兼用两种金属的铁锰兼用型SOD（cambialistic SOD, camSOD）。在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，一对同源SOD同工酶——祖先型的MnSOD（由sodA编码）和新功能化的camSOD（由sodM编码）——为研究蛋白质进化中生化特性的分化和选择提供了理想模型。此前研究已明确，camSOD的金属偏好变化（从严格依赖锰变为可兼用锰或铁）是其新功能化（neofunctionalisation）的核心，但该过程是否同时改变了其他生化特性（如结构稳定性）尚不清楚。研究人员通过多种生物物理手段，系统比较了这对同工酶在化学和热变性条件下的稳定性差异，并利用氢-氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS）深入分析了其构象动力学差异，旨在揭示新功能化过程中是否涉及多性状协同选择。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。

为探究SOD同工酶的结构稳定性差异，研究人员使用了以下关键技术方法：
1. 重组蛋白表达与纯化：在大肠杆菌BL21(DE3) ΔsodAΔsodB菌株中异源表达金黄色葡萄球菌的MnSOD和camSOD，并通过补充培养基中的锰或铁离子实现特异性金属负载，再经阴离子交换和尺寸排阻层析纯化获得金属纯的蛋白样品。
2. 化学和热变性分析：利用色氨酸荧光发射光谱和圆二色光谱（circular dichroism, CD）监测蛋白在不同浓度尿素或盐酸胍中的结构变化；通过CD光谱、纳米差示扫描荧光法（nano differential scanning fluorimetry, nanoDSF）及荧光染料结合热位移分析（thermal shift assay, TSA）评估热稳定性。
3. 氢-氘交换质谱（HDX-MS）：在多个时间点（10秒至24小时）追踪主链酰胺质子与氘代溶剂的交换速率，比较两种同工酶的结构核心区域大小和抗交换能力。

研究结果如下：

**在化学变性剂存在下金黄色葡萄球菌SodFM酶（SodFM）的展开**：通过色氨酸荧光发射光谱和圆二色光谱分析，研究人员发现camSOD比MnSOD更抵抗尿素和盐酸胍诱导的展开。具体而言，铁负载的camSOD对尿素完全抵抗，而Mn负载和Fe负载的MnSOD均在高浓度尿素或盐酸胍下显著展开。CD光谱结合活性染色和EDTA处理实验进一步证实，camSOD在变性剂中保留更多α-螺旋结构和酶活性，表明其整体结构更稳定。

**金黄色葡萄球菌SodFM酶热稳定性的比较**：通过圆二色光谱和纳米差示扫描荧光法监测从25至95 °C的升温过程，研究人员发现MnSOD在高温下呈现明显的两个相变（锰负载形式Tm值分别为57.7和70.0 °C，铁负载形式Tm为70.7 °C），而camSOD仅出现一个较平缓的相变，且在高温度下仍保留较多二级结构。结合Sypro Orange结合实验，camSOD显示出更高的热稳定性，且铁负载形式的稳定性高于锰负载形式。

**SodFM酶中氢-氘交换的整体模式**：通过HDX-MS分析，研究人员发现两种同工酶均存在一个围绕活性位点金属辅因子的稳定核心区域，该区域在长达24小时的氘代溶剂暴露中依然高度抵抗主链酰胺质子交换。快速交换区域主要位于表面环区和N端无序区，而核心区域则包含金属配位残基（H27、H81、D161、H165）及金属特异性决定位点（XD-1和XD-2）。

**MnSOD与camSOD之间氢-氘交换速率的比较**：通过比较两种同工酶中可对比肽段的交换速率，研究人员发现camSOD的核心区域比MnSOD更大且更抗氢-氘交换。显著差异出现在二聚体界面区域，特别是包含保守GSG环（125GSG127）的肽段：该区域在camSOD中几乎不交换，而在MnSOD中数小时内即发生显著交换。此外，金属配位区域在camSOD中表现出更慢的交换动力学，表明其结构核心的氢键网络更强。

在讨论部分，研究人员指出，金黄色葡萄球菌camSOD相对于MnSOD的结构稳定性增强是新功能化过程中的一个额外且重要的生化性状变化。这种稳定性改变可能与金属偏好适应性的选择压力有关，但也可能具有独立的生物学意义，例如在宿主感染时面临营养免疫导致的锰剥夺应激下，更稳定的camSOD有助于维持酶活性。虽然热稳定性变化远高于细菌最适生长温度，但camSOD在胁迫条件下的诱导表达暗示其稳定性可能具有生理相关性。研究还提出，二聚体界面区域在两种同工酶中交换速率的显著差异可能反映了二聚体稳定性的改变，这有待进一步实验验证。研究结论部分翻译如下：因此，在这对SOD的近期分化过程中，两个不同的生化特性（金属偏好与结构稳定性）经历了显著而快速的进化变化。这项研究为探究这些特性之间的结构和功能关系，以及它们如何在金黄色葡萄球菌谱系的新功能化过程中被同时选择奠定了基础。