哺乳动物细胞中生长素诱导型蛋白降解耐药机制的解析

《Journal of Biological Chemistry》：Deciphering resistance mechanisms to auxin-inducible protein degradation in mammalian cells

　　

靶向蛋白降解是研究蛋白功能丧失后即刻下游效应的一种有利策略，例如生长素诱导型降解决定子（auxin-inducible degron，AID）系统。尽管该系统已被广泛应用于细胞和动物模型，但针对长期生长素处理所致降解耐受性的研究尚未开展。随着新型AID2系统的出现，原始AID1系统所需高浓度生长素引起的细胞毒性已不再构成主要顾虑，从而使在延长时间尺度上研究蛋白降解成为可能。在本研究中，研究人员构建了多个miniAID标记的敲入（knock-in）人细胞系以及一株Ctcf-miniAID敲入小鼠，以探究降解耐药的机制。研究揭示了4种相互独立的耐药机制，包括：CTCF编码序列中的无义突变，导致miniAID肽段被移除；miniAID编码区中的错义点突变，破坏了其对泛素复合体的靶向；以及OsTIR1接头蛋白表达降低。在小鼠原代Ctcf_{miniAID/miniAID}敲入B-ALL细胞中，研究人员还在离体（ex vivo）和体内（in vivo）观察到由OsTIR1(F74G)蛋白错义突变介导的生长素降解耐药。通过对哺乳动物细胞中降解决定子耐药机制进行系统表征，研究人员鉴定出AID系统在长期蛋白降解研究中的潜在局限性。

该文发表于《Journal of Biological Chemistry》，聚焦于生长素诱导型降解系统（auxin-inducible degron，AID）在哺乳动物细胞长期应用中的核心瓶颈，即耐药性形成。蛋白质靶向降解技术因能够在蛋白水平实现快速、可逆且时间分辨率高的功能缺失，已成为功能基因组学的重要工具。与shRNA、Cre/LoxP及CRISPR/Cas9等传统失功能策略相比，AID系统可避免较长的基因沉默滞后期，并减少DNA或RNA层面操作带来的部分非靶向效应。特别是AID2系统通过OsTIR1(F74G)与合成生长素类似物5-Ph-IAA配对，显著降低了高剂量生长素的毒性，使长期降解实验成为现实。然而，正如多种基于药物的靶向干预会产生获得性耐药一样，AID系统依赖细胞内源性泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS），因此理论上同样可能在长期选择压力下诱导细胞逃逸降解。此前该问题在哺乳动物体系中尚缺乏系统研究，这正是本研究开展的直接动因。

研究人员围绕生存必需基因的长期降解建立实验体系，重点考察CTCF这一维持染色质高级结构和转录调控的关键转录因子。研究发现，在SEM人B-ALL细胞中，miniAID标记的CTCF在长期5-Ph-IAA处理后频繁出现耐药，而同样采用miniAID标记的RBM5和MBNL1则在相同条件下仍保持对降解诱导的敏感性。进一步结合小鼠Ctcf_{miniAID/miniAID}敲入模型与BCR-ABL驱动的B-ALL原代细胞体系，研究证实AID耐药不仅发生于体外培养的人细胞，也可在小鼠原代细胞及体内白血病模型中出现。总体上，研究明确了AID系统在长期应用中存在多层次逃逸路径，其形成依赖强烈的生存选择压力，并优先作用于降解系统本身或降解标签，而非广泛重塑整个UPS。该结论对于今后利用AID系统研究必需基因长期功能、设计长期蛋白耗竭方案及评估靶向蛋白降解策略的稳定性具有重要方法学意义。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑构建多种人源miniAID敲入细胞系，并利用小鼠受精卵显微注射建立Ctcf_miniAID敲入品系；在SEM细胞、来源于8周龄Ctcf_{miniAID/miniAID}小鼠骨髓的原代前B细胞及其BCR-ABL转化B-ALL模型中实施长期5-Ph-IAA处理；结合免疫印迹、流式细胞术、RT-qPCR、RNA-seq、Sanger测序、扩增子深度测序、免疫沉淀-质谱（IP-MS）及ChIP-seq解析耐药分子基础；并通过CD1 Nude小鼠尾静脉移植、腹腔注射给药和生物发光成像评估体内降解与耐药演化。

以下为论文结果部分的分节解读。

Development and characterization of auxin resistance in CTCF^AID2 human cell lines
研究人员首先在SEM人急性淋巴细胞白血病细胞中建立多个双等位基因CTCF-miniAID-mClover3敲入克隆，并外源表达OsTIR1(F74G)。长期给予1 μM 5-Ph-IAA后，多数克隆早期均出现显著生长抑制，提示持续CTCF耗竭损害细胞适应性。其中Clone 27、3.2、5和17.2在经历生存危机后重新恢复增殖，说明细胞获得了降解逃逸能力。对Clone 27的分析显示，CTCF最初可被有效降解，但持续处理约13天后融合蛋白再次出现；若同步诱导外源WT-CTCF，则内源CTCF-miniAID持续保持可降解状态。这表明耐药的根本驱动力是对必需蛋白CTCF的生存依赖。进一步研究证实，Clone 27耐药与OsTIR1(F74G)表达下降有关：耐药细胞中EGFPminiAID信号消失，RT-qPCR显示OsTIR1(F74G)转录降低，重新导入OsTIR1(F74G)后可恢复CTCF的生长素敏感性。因此，研究首先定义出一种非标签本体的耐药机制，即适配蛋白表达沉默或降低。

Mutation of the degron tag was revealed as a genetic mechanism of auxin resistance
在Clone 3.2中，长期处理后CTCF-miniAID-mClover3蛋白虽仍可被CTCF抗体检测到，却难以被AID抗体识别，提示标签表位或结构发生改变。RNA-seq显示miniAID编码区发生C>T突变，导致第23位脯氨酸变为丝氨酸，即P23S错义突变。研究人员进一步在293T细胞中重建AID-P23S突变体，证实该突变可使EGFP融合蛋白在5-Ph-IAA处理后不再降解，同时AID抗体也无法有效识别。重复长期处理实验与Sanger测序再次确认该突变可重复出现。由此可见，miniAID标签本身在长期选择压力下可发生功能性点突变，破坏其与OsTIR1(F74G)-SCF复合体的有效识别，从而导致降解失效。

Missense mutation Q666* in CTCF caused early truncation to exclude the degron tag and escape auxin degradation
在Clone 17.2中，长期处理后研究人员观察到一条较短的CTCF截短蛋白条带。该条带可被CTCF抗体识别，但不能被AID抗体检测，提示其C端连同miniAID标签一并丢失。通过CTCF免疫沉淀结合质谱（IP-MS）和RNA-seq，研究人员确认CTCF第666位谷氨酰胺发生无义突变Q666*，使蛋白在外显子11处提前终止，从而去除3’端及miniAID-mClover3标签。扩增子深度测序显示该突变在长期处理过程中逐步富集，并非原始群体中可检测到的预存变异。为评估截短体的功能，研究人员构建可诱导表达的CTCF^WT-HA与CTCF^Q666*-HA体系，并实施ChIP-seq比较。结果表明，尽管CTCF^Q666*保留核心锌指DNA结合结构域，整体染色质结合仍可维持，但在7727个峰位点其结合强度低于CTCF^WT，例如在MYC位点结合及转录激活减弱。这说明Q666*并非完全等效于全长CTCF，而是以“近功能性”截短体形式在强选择压力下保留足够生存功能，同时去除降解决定子标签以逃逸降解。

Auxin resistance is selective and requires survival pressure
为判断耐药是否具有普遍性，研究人员进一步在同一SEM细胞系中构建RBM5和MBNL1的miniAID敲入模型。长期5-Ph-IAA联合Zeocin处理超过23天后，这两种融合蛋白仍持续对生长素敏感，且细胞未出现明显增殖抑制。该结果说明AID耐药并非所有靶蛋白长期处理后的必然结局，而更可能与靶蛋白是否构成强生存依赖有关。换言之，只有当持续降解造成显著适应性压力时，细胞才更倾向于演化出逃逸机制。

Establishment and validation of the Ctcf_{miniAID/miniAID} BCR-ABL B-ALL mouse model
为检验上述现象是否超越人肿瘤细胞系、可在原代及体内环境中重现，研究人员建立了Ctcf_miniAID敲入小鼠。该模型通过将miniAID无缝插入Ctcf终止密码子前，成功获得可存活且可繁殖的纯合Ctcf_{miniAID/miniAID}个体。随后研究人员从8周龄小鼠骨髓分离前B细胞，经BCR-ABL、Cas9和sgArf转导建立B-ALL模型。该原代白血病细胞具有典型BCR-ABL转化特征，并在导入OsTIR1(F74G)后可于5-Ph-IAA处理2小时内快速降解Ctcf-miniAID，撤药后可恢复表达。长期处理过程中，细胞先经历显著生长危机，后于约第14天恢复增殖，并重新表达全长Ctcf蛋白。RNA-seq未发现Ctcf或miniAID突变，而重新导入OsTIR1(F74G)可恢复降解敏感性，Sanger测序则识别出OsTIR1(F74G)中的G142V错义突变，说明原代小鼠细胞中耐药主要由适配蛋白遗传改变驱动。

In vivo modeling of auxin resistance
研究人员进一步将表达荧光素酶的Ctcf_{miniAID/miniAID} BCR-ABL B-ALL细胞移植入CD1 Nude小鼠，并自移植第2天起每日腹腔注射5-Ph-IAA。短期体内给药可在外周血和骨髓中迅速诱导Ctcf-miniAID降解，证明AID2系统在体内有效。然而长期给药后，尽管治疗组白血病负荷出现延迟，最终仍有4/5小鼠发展出明显白血病负荷；终点样本免疫印迹显示Ctcf-miniAID表达已恢复，提示体内同样发生降解逃逸。由此，研究将AID耐药的观察从体外细胞培养扩展至真实体内疾病进程。

OsTIR1(F74G) mutation led to auxin resistance in vivo
将终点白血病细胞取出并离体培养后，再次给予5-Ph-IAA处理，来自PBS组的小鼠白血病细胞仍可正常降解Ctcf，而长期5-Ph-IAA组来源细胞则在6小时和24小时后均表现为耐药。Sanger测序证实，3只独立小鼠的耐药细胞均携带OsTIR1(F74G)中的同一T>A错义突变，导致W91R氨基酸替换。研究人员通过定点突变重建OsTIR1(F74G/W91R)，并证实表达该突变蛋白的细胞失去对Ctcf-miniAID的降解能力。该结果表明，在体内长期生存选择压力下，OsTIR1(F74G)可发生重复性热点突变，从而直接破坏AID2系统功能。

在讨论部分，研究人员强调，本研究系统揭示了哺乳动物细胞中AID长期应用的多个耐药通路，且这些通路集中作用于AID系统关键节点，包括靶蛋白编码区提前终止以切除标签、miniAID标签本身功能性点突变、OsTIR1(F74G)表达降低，以及OsTIR1(F74G)错义突变。与PROTAC耐药多由UPS复合体成员改变所致不同，本研究显示AID系统的脆弱点更多集中在降解决定子标签及外源适配蛋白本身。研究还指出，CTCF作为高度必需且缺乏明显替代通路的染色质架构调控因子，能够提供足够强的选择压力驱动耐药演化；相比之下，RBM5和MBNL1未出现相同现象，提示靶基因依赖性是耐药形成的重要前提。文章同时指出研究范围主要集中于SEM细胞和小鼠B-ALL模型，仍需在更多基因和细胞背景中验证其普遍性。

研究结论部分可概括为：研究人员系统表征了哺乳动物细胞中降解决定子耐药的机制，鉴定出AID系统在长期蛋白降解研究中的潜在局限性。该研究揭示，在持续生存选择压力下，细胞可通过多种遗传与表观层面的方式逃避AID介导的蛋白降解，因此在设计长期AID实验及未来相关应用时，需要充分考虑并尽可能预防耐药的发生。